令和４年１２月２１日判決言渡
令和３年（行ケ）第１０１２９号審決取消請求事件
口頭弁論終結日令和４年１０月３１日
判決
原告ツールゲンインコーポレイテッド
同訴訟代理人弁護士奥村直樹
同西村英和
同訴訟代理人弁理士田代玄
同滝澤敏雄
被告特許庁長官
同指定代理人長井啓子
同上條肇
同井上千弥子
同宮岡真衣
主文
１ 原告の請求を棄却する。
２ 訴訟費用は原告の負担とする。
３ この判決に対する上告及び上告受理申立てのための付加期間を３０日と定める。
事実及び理由
第１ 請求
特許庁が不服２０２０－００００１３号事件について令和３年６月８日にした審決を取り消す。
第２ 事案の概要
本件は、特許拒絶査定の不服審判請求を不成立とした審決の取消訴訟である。
１ 特許庁における手続の経緯等（当事者間に争いがない。）
⑴原告は、平成２９年８月１０日、名称を「標的ＤＮＡに特異的なガイドＲＮＡおよびＣＡＳタンパク質コード核酸またはＣＡＳタンパク質を含む、標的ＤＮＡを切断するための組成物、ならびにその使用」とする発明について、特許出願（特願２０１７－１５５４１０号。平成２５年１０月２３日〔パリ条約による優先権主張平成２４年１０月２３日米国平成２５年３月２０日米国平成２５年６月２０日米国〕を国際出願日とする特願２０１５－５３８０３３号の一部を新たな特許出願としたもの。以下「本件出願」という。請求項の数４１）をし、平成３０年９月１４日付けの拒絶理由通知を受けたことから、平成３１年３月２５日、手続補正書を提出したが（以下、この手続補正書による補正を「本件補正」という。）、令和元年８月２６日付けの拒絶査定を受けた。
⑵原告は、令和２年１月６日、拒絶査定不服審判請求をし、特許庁は、上記請求を不服２０２０－００００１３号事件として審理を行い、令和３年６月８日、「本件審判の請求は、成り立たない。」との審決（以下「本件審決」という。附加期間９０日）をし、その謄本は、同月２９日、原告に送達された。⑶原告は、令和３年１０月２５日、本件審決の取消しを求める本件訴訟を提起した。
２ 特許請求の範囲の記載
本件補正後の請求項１の発明（以下「本願発明」という。）に係る特許請求の範囲の記載は、次のとおりである。
真核細胞における標的デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の切断のためのタイプⅡのクラスター化された規則的間隔の短いパリンドローム反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓシステムを含む組成物であって、該ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが
（ｉ）Ｃａｓ９ポリペプチドおよび核局在化シグナルをコードする核酸、または核局在化シグナルを有するＣａｓ９ポリペプチド、および
（ⅱ）真核細胞中の標的ＤＮＡにハイブリダイズするガイドＲＮＡまたは該ガイドＲＮＡをコードする核酸、
を含み、ガイドＲＮＡがトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列に融合したＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）配列を含むキメラガイドＲＮＡであり、該ｃｒＲＮＡ配列が該ｔｒａｃｒＲＮＡ配列に対して５′末端側にある、上記組成物。
３ 本件審決の理由の要旨
本件審決は、本願発明は、本件出願の第１の優先日である平成２４年１０月２３日（以下「本願第１優先日」という。）より前に日本国内又は外国において頒布等された甲第２０号証「ＡｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅＤｕａｌ－ＲＮＡ－ＧｕｉｄｅｄＤＮＡＥｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｉｎＡｄａｐｔive ＢａｃｔｅｒｉａｌＩｍｍｕｎｉｔｙ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ａｕｇ２０１２、Ｖｏｌ．３３７、ｐ．８１６－８２１＆ＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙＭａｔｅｒｉａｌｓ」（以下「引用文献１」という。別紙２参照）に記載の発明（以下「引用発明」という。）と周知技術に基づいて当業者が容易に発明することができたものであるから、本件出願は拒絶すべきものと判断した（以下、本件出願に係る願書に添付した明細書を、図面を含めて「本願明細書」という。別紙１参照）。
その判断の要旨は以下のとおりである。
⑴引用発明の認定
クラスター化され、規則的に間隔が空いている短い回文の反復（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）系を含む組成物であって、
(ａ)Ⅱ型Ｃａｓ９タンパク質、及び
(ｂ)ｃｒＲＮＡの３′末端側にｔｒａｃｒＲＮＡの５′末端側が融合したキメラＲＮＡ
を含み、キメラＲＮＡと塩基対を形成する、プラスミド中の標的ＤＮＡを緩衝液中で切断するための組成物。
⑵本願発明と引用発明との一致点
標的デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の切断のためのタイプⅡのクラスター化された規則的間隔の短いパリンドローム反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓシステムを含む組成物であって、該ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが
（ｉ）Ｃａｓ９ポリペプチド、および
（ⅱ）標的ＤＮＡにハイブリダイズするガイドＲＮＡ、
を含み、ガイドＲＮＡがトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列に融合したＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）配列を含むキメラガイドＲＮＡであり、該ｃｒＲＮＡ配列が該ｔｒａｃｒＲＮＡ配列に対して５′末端側にある、上記組成物。
⑶本願発明と引用発明との相違点
ア 相違点１
本願発明は、「真核細胞」における標的ＤＮＡを切断するための組成物であって、Ｃａｓ９ポリペプチドが「核局在化シグナル」を有しているのに対して、引用発明は、「緩衝液中」の標的ＤＮＡを切断するための組成物であって、Ｃａｓ９ポリペプチドが「核局在化シグナル」を有していない点。
イ 相違点２
本願発明は、Ｃａｓ９ポリペプチド及びガイドＲＮＡが、それらをコードする核酸である態様も含まれているのに対し、引用発明は、そのような態様が含まれていない点。
⑷相違点の容易想到性
ア 相違点１
引用文献１においては、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系をゲノム編集に利
用する可能性が強調され（８１６頁要約）、ゲノムを操作するための人工酵素として大きな関心を集めたジンク－フィンガーヌクレアーゼ（以下「ＺＦＮ」という。）や転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（以下「ＴＡＬＥＮ」という。）を例示した上で、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系が遺伝子ターゲティングとゲノム編集への応用に向けた大きな潜在能力をもたらし得る代替的な手法として提案されている（８２０頁右欄２ないし９行目）。
本願第１優先日当時、ゲノム編集の主たる対象は真核細胞であって、
ＺＦＮやＴＡＬＥＮが真核細胞中の標的ＤＮＡすなわち核内のゲノムを切断するものであることは周知であったから（甲２１ないし２４、２５の１及び２、２６の１及び２）、引用文献１の記載に接した当業者にとって、引用発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を真核細胞の核内のゲノムに対して機能させようと試みることは、ごく自然な発想である。また、本願第１優先日当時、タンパク質や核酸を真核細胞へ送達する各種手段は周知であり（甲２５の１及び２、２６の１及び２）、タンパク質を真核細胞の核内に移行させるための手段も周知であったから（甲２７ないし２９）、当業者が前述のごく自然な発想を抱くことを妨げる特段の事情があったとはいえない。
したがって、引用発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を、真核細胞にお
ける標的ＤＮＡの切断に用いることは当業者が容易に想到し得ることであり、その際に、真核細胞の核内に移行させるための常套手段である核局在化シグナルを引用発明のＣａｓ９ポリペプチドに付加することは、当業者が格別の創意工夫なくなし得たことであるといえる。
イ 相違点２
本願第１優先日当時、細胞内で機能させるためのタンパク質やＲＮＡを、それらをコードする核酸の形態で細胞に導入することは常套手段であり、また、そのような核酸を真核細胞へ送達する手段も周知であった（甲２５の１及び２、２６の１及び２）。
そして、前記アで検討したとおり、引用発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を真核細胞の核内のゲノムに対して機能させようとすることが十分に動機付けられる以上、それらを構成する成分であるＣａｓ９ポリペプチド及びキメラＲＮＡを、それらをコードする核酸の形態で導入することも、当業者が適宜なし得たことにすぎない。
ウ 本願発明の効果について
本願明細書の記載を参酌しても、本願発明が、引用文献１に記載された発明及び本願第１優先日当時の周知技術からは当業者が予測できない顕著な効果を奏するものとは推認できない。
４ 取消事由
引用発明に基づく本願発明の進歩性判断の誤り
第３ 当事者の主張
１ 原告
⑴相違点１の容易想到性判断の誤り
ア 真核細胞における標的ＤＮＡに適用する点について
阻害要因
以下に阻害要因として掲記するとおり、原核細胞と真核細胞との間に
は多くの相違点や隔たりが存在しており、このようなことから、本願第１優先日当時、当業者は、原核細胞に由来するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系の適用は生体外系や原核細胞系等、真核細胞以外の系に制限されると考える。
なお、被告は、引用文献１が実験材料そのものとして原核細胞や真核
細胞を使っていない旨主張するが、引用文献１において用いられるプラスミドが原核細胞に由来するＤＮＡであるなど、使用されているシステム自体が原核細胞由来のものであるという大前提には変わりはない。引用文献１は、要するに、原核細胞に起源のあるシステムを僅かに改変して緩衝溶液中のプラスミドに適用したというものであり、その改変は真核細胞を意図したものではない。試験管内でのプラスミドを用いたＤＮＡｃｌｅａｖａｇｅ（切断）試験は最も基本的なステップであって、むしろ原核細胞のＤＮＡをｃｌｅａｖａｇｅ（切断）する試験よりも容易であるとさえいえる。
ａ 阻害要因１
Ｃａｓ９ポリペプチドは、真核細胞の細胞質で発現され、細胞質に
おいて正しく折り畳まれて適切なマルチドメイン構造を形成し、かつ、ユビキチン経路のような、異常タンパク質を排除する真核細胞性タン
パク質分解経路により分解されることなく安定性を保持する必要があ
る（甲１８、７７）。すなわち、Ｃａｓ９ポリペプチドを含め、一般的にタンパク質は細胞核ではなく、細胞質と呼ばれる細胞内の領域で合
成されて、そこで機能できるような形に折り畳まれている。一方、Ｃ
ａｓ９ポリペプチドのように真核細胞内に本来的に存在しないタンパ
ク質は、ユビキチン経路と呼ばれる真核細胞に存在するタンパク質分
解経路によって認識されて分解される可能性がある。それゆえ、ＣＲ
ＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系が真核細胞内で機能するためにはこの分解経路
をすり抜ける必要が存在した。
しかしながら、本願第１優先日当時の当業者は、ガイドＲＮＡと複
合体を形成する以前に、Ｃａｓ９ポリペプチドが産生され、正しく折
り畳まれ、ユビキチン経路からの攻撃を回避し得るかを知るものでは
なかった。本願第１優先日当時、タンパク質が、その本来の細胞では
なく、他の細胞において発現される場合には、異なる折り畳みが生じ
ることがあり、不完全に折り畳まれたタンパク質が活性を欠いたり、
異常機能を示したりして、ユビキチン経路により異常タンパク質と認
識され、分解され得ることがよく知られていた。
さらに、本願第１優先日当時の当業者は、天然のコドン使用頻度の
重要性を認識しており、コドンの変化がタンパク質の翻訳に動力学的
な変化を生じさせ、その結果、誤った折り畳みのせいでタンパク質の
活性を変化させ得ることも認識していた。すなわち、アミノ酸をコー
ドするコドンの使用頻度は真核生物と原核生物とで異なり、その結果、たとえコードされているアミノ酸が同じであっても、タンパク質生成
時におけるｍＲＮＡからアミノ酸により構成されているタンパク質へ
の翻訳速度が変化することがあり、翻訳速度が遅いと早い段階で折り
畳みが始まって本来とは違う形に折り畳まれることがあり、そうする
とＣａｓ９ポリペプチドの折り畳みに影響が出る可能性がある（甲１
８）。
被告は、分解等の懸念があるのであれば、核酸の導入量を増やすな
どの実験の最適化を当業者は行う旨を主張するが、自らのものではな
い異種タンパク質を大量に細胞内で発現させ、あるいは細胞内に導入
すれば、細胞に有害であることは明らかである。また、導入量を増や
せばそれだけ、標的外のＤＮＡを切断するオフターゲットの危険性も
上昇する。したがって、そのようなリスクの大きい手法を当業者が簡
単に講じることはできない。
ｂ 阻害要因２
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を用いて真核細胞中のＤＮＡ切断を実現
するためには、ガイドＲＮＡが真核細胞性のヌクレアーゼによる分解
を逃れる必要が存在した。すなわち、本願第１優先日当時の当業者は、真核細胞の細胞質及び核がＲＮＡを切断するエキソヌクレアーゼ等の
リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）を含有しており、それらがＲＮＡを
迅速に分解すること、また、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系のガイドＲＮ
Ａが、かかるエキソヌクレアーゼ等により仲介される分解からＲＮＡ
を保護するために真核細胞性ＲＮＡが用いる改変（例えば、ＲＮＡの
５′側における修飾である５′キャッピング及び３′側における修飾
である３′ポリアデニル化）を有しないこと、特に、ガイドＲＮＡの
５′及び３′末端の両方が裸のままであると、端から順にＲＮＡを切
断するエキソヌクレアーゼ等の攻撃の標的とされて分解されてしまう
ことを認識していた（甲８１の７６３頁）。さらに、本願第１優先日当時の当業者は、ガイドＲＮＡに対して、上記のヌクレアーゼ等からの
攻撃を緩和する改変を追加すると、そのような改変がかえってＲＮＡ
をリボソームや他のタンパク質複合体のような真核細胞性構造体を動
員する役割を果たし、ガイドＲＮＡとＣａｓ９ポリペプチドとの複合
体形成を阻害すると理解していた。
また、当業者は、ＲＮＡを発現させるために、ＤＮＡ上の領域であ
るＲＮＡポリメラーゼⅢ(ｐｏｌⅢ)プロモーターを使用しようとするはずであるが、真核細胞においてｐｏｌⅢプロモーターから産生されるガイドＲＮＡは、核又は仁（核小体）中の豊富にある分子シャペロン
タンパク質（Ｌａタンパク質）に結合され、それらに保持される。分
子シャペロンは、一般には他のタンパク質が正確な折り畳みを行うよ
うに補助する分子であり、ＲＮＡの折り畳みにも関与する分子である
が、分子シャペロンがその機能を発揮しようとしてガイドＲＮＡに結
合すると、この分子シャペロンタンパク質は、ガイドＲＮＡがＣａｓ
９ポリペプチドと相互作用したり、ガイドＲＮＡとＣａｓ９ポリペプ
チドが機能性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体を形成することに干渉す
ると当業者は理解していた（甲１８）。
ｃ 阻害要因３
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を活用して真核細胞の標的ＤＮＡを切断
するためには、ガイドＲＮＡ及びＣａｓ９ポリペプチドが核内へと活
性を有した状態で輸送される必要があり、真核細胞性の遮断因子との
相互作用によって阻害されることなく近接して、複合体を形成する必
要がある。
しかしながら、当業者は、真核細胞に特有の区画化された構造（特
に核膜）が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系が真核細胞のＤＮＡにアクセ
スする上で顕著な追加の障害になると理解していた。すなわち、真核
細胞のＤＮＡは、核内に折り畳まれており、それゆえ、ＤＮＡは細胞
質から核膜により物理的に隔離されている。一方、Ｃａｓ９ポリペプ
チドは細胞核とは異なる細胞質で生成され、細胞核内へのアクセスの
ためには核膜という物理的障壁を通過する必要がある。このようなこ
とから、当業者は、核膜のような物理的障壁のない原核細胞に由来す
る引用文献１のＣａｓ９ポリペプチドが、真核細胞の細胞質からその
核内へと移動し、次いでガイドＲＮＡを見つけ出しそれと機能可能な
正しい複合体を形成することが起きることについて否定的であった。
ｄ 阻害要因４
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体は、真核細胞のＤＮＡがクロマチン
に折り畳まれているにもかかわらず、ＤＮＡにアクセスした上で、真
核細胞のＤＮＡを所望のように走査できる必要がある。
しかしながら、本願第１優先日当時、当業者は、細菌のＤＮＡは原
核細胞内でいわば裸の状態で存在するので自由にアクセス可能である
のに対して、真核細胞のＤＮＡはクロマチン内に存在するため自由に
アクセスすることが困難であると理解していた。これは、クロマチン
がヒストンタンパク質等の真核細胞に特有の構成要素とＤＮＡとが、
複雑に折り畳まれた、高度に充填された構造であり、それによって真
核細胞の巨大なＤＮＡが核内に密に詰め込まれているからである（甲
８２）。このような相違から、当業者は、真核細胞性ではない酵素や、原核細胞性の部位特定基遺伝子標的化システム（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａ
ｓ９系はこの一種である。）を真核細胞で使用することは阻まれると認識していた（甲５０、５１、１８）。
ｅ 阻害要因５
真核細胞のゲノムは、比較的小さな原核細胞のゲノムや原核細胞に
作用するウイルスのゲノムと比較して顕著に大きく、かつ高度に充填
されたクロマチン構造として折り畳まれている。そして、真核細胞の
ゲノムを切断する場合、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系は、真核細胞の巨
大なゲノム中にある、特異的なＤＮＡ標的配列を成功裏に認識し、そ
れに結合する必要がある。
本願第１優先日当時、哺乳動物のゲノムは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ
９系が天然で機能するバクテリオファージのゲノムよりも、ゲノムサ
イズが何桁も大きいことが知られていた。具体的には、ヒトゲノムの
大きさは、約３.２ギガｂｐ（３２３４メガｂｐ）であるのに対して（甲５４）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系の天然ＤＮＡ標的を保有するバクテリオファージの一種であるＴ４ウイルスのゲノムは、約１６９キロｂ
ｐであり、これはヒトゲノムの約１万９０００分の１である。当業者
は、ゲノムサイズのこの顕著な違いから、原核細胞内で機能し、バク
テリオファージのゲノム等を標的として進化してきたＣＲＩＳＰＲ／
Ｃａｓ９系が、１万倍もサイズの大きい真核細胞のゲノム内で標的配
列にアクセスしそれを特異的に切断することは、不可能又は相当な困
難を伴うと認識していた（甲１８）。
その上、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系は、ＰＡＭ配列（プロトスペー
サー隣接モチーフ５′―ＮＧＧ―３′）に近い７ないし１２塩基の
みが特異性（狙った箇所のみを切断する性質）として重要であり（甲
９３）、見かけ上のｃｒＲＮＡ全体の長さよりも特異性が低い（甲９４、９５）。これは、原核細胞に由来するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系は、本来的には、比較的単純なゲノムしか持たないファージ（細菌に感染す
るウイルスの一種）に対する免疫機構であるという性質上からである。そして、このような特異性の低さから、ゲノムサイズの大きい真核生
物を標的とする場合には標的外のＤＮＡを切断するオフターゲットの
可能性が高まることとなり、真核生物への適用は現実的ではないと認
識されていた。
ｆ 阻害要因６
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体を用いて真核細胞中のゲノムＤＮＡ
を切断するためには、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体が真核細胞内の
低濃度マグネシウムイオンという条件下でも酵素活性を維持する必要
がある（甲１８）。本願第１優先日当時、原核細胞と真核細胞（例えば、哺乳動物細胞）とでは遊離マグネシウム濃度が大きく異なることが当
業者には広く知られていた。そうすると、当業者は、低濃度のマグネ
シウムイオン環境である真核細胞においては、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ
９複合体を適用してＤＮＡを切断することはできないものと認識する。すなわち、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体は、切断反応にマグネシ
ウムイオンを必要とし、その活性もマグネシウム濃度に依存する。引
用文献１にも、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体が、１ｍＭの場合より
も、５ｍＭというＭｇ２＋濃度において有意により効果的に機能する
ことを教示している（８１６頁右欄２６ないし２８行目、
SUPPLEMENTARY MATERIALS AND METHODS の「ＰｌａｓｍｉｄＤＮＡｃｌｅａｖａｇｅａｓｓａｙ」、図Ｓ４）。一方、真核細胞における細胞内Ｍｇ２＋濃度は、一般には１ｍＭ未満であり、例えば、典型的な哺乳動物細胞の
細胞内のＭｇ２＋濃度は０.５ｍＭ程度である（甲１８）。これに対して、引用文献１は、真核細胞がＣａｓ９ポリペプチドが機能し得る十分な
量の遊離マグネシウムを含有することについては何ら開示していない。しかも、引用文献１に係る実験は生体外（ｉｎｖｉｔｒｏ）で、高濃度のＣａｓ９ポリペプチド及びＤＮＡを使用して行われたものであるが、こ
のような条件は真核細胞内では生じ得ない。
そして、本願第１優先日当時、当業者は、本願発明と同様に原核細
胞性であり、エンドヌクレアーゼ（核酸切断酵素）を有するグループ
Ⅱイントロンシステムについての確立された先例を熟知しているとこ
ろ、このグループⅡイントロンシステムは、特定の実験条件下で人工
的に高レベルのマグネシウムイオンを添加した後に初めて、真核細胞
において機能したことが知られている（甲５３の６頁左欄１１ないし
１５行目）。
そうすると、本願第１優先日当時の当業者は、グループⅡイントロ
ンシステムの確立された先例や引用文献１の教示に基づき、ＣＲＩＳ
ＰＲ／Ｃａｓ９系は、グループⅡイントロンシステムの場合と同様に、Ｍｇ２＋条件の制限を受ける蓋然性が非常に高く、真核細胞の生理学
的Ｍｇ２＋濃度では効率的に機能しないと結論付けたものである。
ｇ 阻害要因７
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系が真核細胞で機能するためには、細胞毒
性（細胞傷害性）の問題を克服する必要がある。
すなわち、ガイドＲＮＡのような構造をもつＲＮＡは一般に細胞に
とって異物であり、有害であると認識されて細胞による攻撃の対象と
なり得るから、これを真核細胞に導入することに伴う細胞毒性の可能
性がある。例えば、５′三リン酸を特徴とする構造化されたＲＮＡ分
子は、ＲＩＧ－Ｉのようなパターン認識受容体を活性化し、抗ウイル
ス作用を示すインターフェロン産生の誘導（細胞性インターフェロン
応答）等の生来的な免疫応答を惹起することが知られていた（甲６５
の１頁要約、甲８３の９９７頁要約、甲８４）。そして、構造化されたＲＮＡモチーフ、例えば、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）の領域は、真
核細胞内で種々のｄｓＲＮＡ結合型タンパク質と相互作用し、細胞性
の抗ウイルス免疫機構の一部としてインターフェロン応答を惹起する
ことが知られていた。
また、Ｃａｓ９ポリペプチドは、限られた大きさしかない原核細胞
ゲノム内の固有の標的配列を認識するように天然において進化したも
のであり、限られた配列特性しか要求されておらず、ｃｒＲＮＡ配列
は一般には長くはないので、ゲノムサイズが大きい真核細胞において
は、特異性の低いｃｒＲＮＡが誤った箇所を切断する可能性がある。
そのため、オフターゲットＤＮＡ配列（本来の標的ではないＤＮＡ配
列）に結合すること等により引き起こされる細胞毒性（細胞傷害性）
の問題を克服する必要もある。当業者は、Ｃｒｅレコンビナーゼ（バ
クテリオファージ由来の遺伝子組換酵素）やＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９
系のような原核細胞性の遺伝子編集システムを、より顕著に大きなゲ
ノムサイズを有する真核細胞に導入する場合、真核細胞のゲノムはそ
の大きさの違いに比例して、より多くの非特異的標的部位を有すると
予測され、それがランダムなオフターゲット活性及び細胞毒性をもた
らすと予測する（甲１８）。
被告は、オフターゲット切断がされても、細胞にはＤＮＡ修復機構
があるから引用発明の真核細胞への適用には支障がない旨主張するが、細胞のＤＮＡ修復機構には限界があり、一定限度を超えれば本来の機
能が変化することは当業者にとって自明な事項である。あらゆるＤＮ
Ａ切断がＤＮＡ修復機構によって容易に修復されるのであれば、そも
そもゲノム編集自体が不可能である。
本願第１優先日当時における当業者の認識及び技術常識
ａ 本願第１優先日当時、真核細胞由来ではないシステム及び遺伝子を真核細胞において機能させる数々の試みが失敗していたことが知られ
ていた（甲１８）。
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの事例
天然では原核細胞内で作動し、ＤＮＡからＲＮＡへの転写を駆動
することにより遺伝子発現に関与するバクテリオファージ由来の
酵素であるＴ７ＲＮＡポリメラーゼが、クロマチンにアクセスし、
クロマチンを構成するＤＮＡからＲＮＡを伸長する能力を欠くこ
とから、真核細胞内では正しく機能し得ないことが知られていた
（甲５０ないし５２）。
⒝グループⅡイントロンシステムの事例
グループⅡイントロンシステムの遺伝子標的化作用に対して、真
核細胞のクロマチンが顕著な障壁となることが知られていた。
さらに、グループⅡイントロンが機能するためには、人工的技術
によってしか真核細胞内で達成できない量の遊離マグネシウムが
必要であることも知られていた。
⒞リボスイッチの事例
ｍＲＮＡの一部分であるリボスイッチは、リガンド（タンパク質
等の生体物質と結合する物質）に応答して原核細胞内で遺伝子発現
（ｍＲＮＡからタンパク質が製造されること）を制御するが、ＲＮ
Ａ構築物の折り畳みが試験管と細胞内とで異なる可能性があるこ
となどから、当初は真核細胞内での遺伝子発現制御のための潜在的
なツールとして脚光を浴びたものの、有用な遺伝子発現を制御する
スイッチとなることを妨げられたことが知られている（甲１８、５
９の１１９０頁左欄下から５ないし４行目）。
⒟リボザイムの事例
リボザイムは生化学反応を触媒するＲＮＡ分子であり、ｉｎｖｉｔｒｏ（生体外）では有効であったが、ｉｎｖｉｖｏ（生体内）では予測どおり機能しなかった。これは、リボザイムが標的ＲＮＡへ結合することに
対する細胞内タンパク質の干渉、リボザイム機能に不十分な細胞内
イオン濃度及びＲＮＡｓｅ（リボヌクレアーゼ）によるリボザイム
への攻撃が理由であることが知られていた（甲１８、６０）。
ｂ 当業者は、本願第１優先日当時、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系が真核細胞内で機能し得ることについては専ら否定的な見解を有していた。
本願第１優先日前後の文献には、本願第１優先日当時について、例
えば、「このような細菌系が真核細胞で機能するかどうかは知られていなかった。」（甲４８の２頁）、「(この発表は)大きな成功であったが、問題があった。我々には、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系が真核生物－植
物及び動物細胞で機能するか否か確かではなかった。」（甲４９の４頁）、「Ｄｏｕｄｎａは、ＣＲＩＳＰＲをヒト細胞で機能させることについて「多くの挫折」を経験し、これに成功すれば、ＣＲＩＳＰＲは「非常に大
きな発見」となることを知っていた。」（甲３７の３頁）、「生物の遺伝子の特定の要素を改変する能力は、ヒトの健康を含む生物学の理解を
進展させるために不可欠であった。・・・しかし、動物およびヒトにおけるこれらの改変を行う技術は、ヒト治療学における研究および開発
の双方において巨大な障害となってきた。」（甲８７の２頁）、「真核細胞におけるシステムの活性はどうか？ジンクフィンガー及びＴＡＬ
Ｅモジュールの双方は、クロマチン内の標的に結合する天然の転写因
子由来である。これはＣＲＩＳＰＲ成分には当てはまらない。Ｃａｓ
９ポリペプチドがクロマチン標的に対して効果的に作用すること、又
は必要なＤＮＡＲＮＡハイブリッドがこの状況で安定化され得ること
について何の保証もない。この構造は、いずれもがＲＮＡ複製の際に
ＲＮＡプライマーの除去のために機能するリボヌクレアーゼＨ及び／
又はＦＥＮ１によるＲＮＡ加水分解の基質となり得る。真核生物にお
けるシステムに適用する試みのみが、これらの懸念事項に対処するこ
とになるであろう。」（甲４１の１６６０頁中欄９行目ないし右欄６行目）、「私の見解では、２０１２年の時点において当業者が真核細胞においてＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムが機能することを予測できな
かったであろうという直接的な同時期の証拠が、【Ａ】２０１２の発表後の本技術分野の研究者らの同時期になされた言説と彼らの実施経過と
いう形で存在する。」（甲９２の１５６ないし１６４段落）、「昨日、【Ｂ】にメールで伝えたように、【Ｃ】のデータは、８月の最初の結果が再現不可能であることが判明したけれども、論文にはなっておらず、その
後の実験に照らして、おそらく何らかのコンタミネーションがあった
と思われる。」（甲９６）等の記載がみられる。
ｃ 本件審決は、相違点１を想到する動機付けとなるとして以下の文献の記載を引用するが、誤りである。
すなわち、甲第４１号証（本件審決の参考資料５）には、「試してみ
る価値が明らかにある」との記載があるが、「真核細胞」ということが明示されているわけではないし、真核細胞へ適用するに当たって考え
られる各技術的障害をいかに克服するかも何ら検討しておらず、単な
る当業者の願望を記載したものにすぎない。また、甲第４９号証（本
件審決の参考資料１３）には、「真核細胞において」との記載はあるが、本願第１優先日後の文献であり、これを根拠にして本願第１優先日当
時、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を真核細胞に適用しようとすることに
動機付けがあったことが示唆されることはない。甲第４８号証（本件
審決の参考資料１２）も本願第１優先日の後の文献であり、その記載
内容も、バクテリアシステム（細菌系）で発見されたゲノム編集技術
が、真核細胞において機能することについては否定的な見解がとられ
ていたことを示唆するものである。
ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮとＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系との相違
以下のとおり、ＺＦＮやＴＡＬＥＮといった従来技術の活用例から、
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を真核細胞へと適用することの動機付けを見いだすことはできない。
ＺＦＮは、真核細胞のゲノムＤＮＡに結合するように自然に進化した
ジンクフィンガーモジュールと、細菌由来であるがＺＦＮが発明された時点でゲノムＤＮＡ配列を切断する機能が周知であったＤＮＡ切断酵素であるＦｏｋ１酵素とを人工的に結合させたものであり、ＴＡＬＥＮは、真核細胞である植物細胞のゲノムＤＮＡ配列に結合するように自然に進化した細菌タンパク質（ＴＡＬエフェクター）に上記Ｆｏｋ１酵素を人工的に結合させたものである（甲９０）。ＺＦＮやＴＡＬＥＮは、切断するＤＮＡを認識するのも、ＤＮＡを切断するのもタンパク質である。また、Ｆｏｋ１酵素部分は二量体化が必要なため、ＺＦＮやＴＡＬＥＮは２つの分子を設計して一組として使用する必要がある。そして、ＴＡＬＥＮで使用するＴＡＬＥＮモジュールもＺＦＮで使用するジンクフィンガーも、真核細胞内のクロマチン環境の中で標的と結合する天然の転写因子及び天然の構造に由来しており、原核細胞には存在しないものであって、原核生物の系を真核生物へと移植したものではない。
これに対して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系は、本来的に原核細胞に由
来するものであり、Ｃａｓ９ポリペプチドは、真核細胞におけるＤＮＡ配列と結合するために進化したものではなく、ウイルス配列を切断するために進化したＤＮＡ切断酵素である。そして、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系は、ガイドＲＮＡとＣａｓ９ポリペプチドは直接結合しておらず、非共有結合によって複合体を形成していて、ガイドＲＮＡが切断するＤＮＡを認識し、Ｃａｓ９というポリペプチドがＤＮＡを切断する。また、ＤＮＡを切断するためにＣａｓ９ポリペプチドの二量体化は不要なため、２つの分子を設計する必要はなく、ＲＮＡ－ＤＮＡ相互作用を利用することから、ガイドＲＮＡがゲノムなＤＮＡに結合する過程では、ＤＮＡの巻き戻し（ＤＮＡの二重らせん構造の開放）が行われる。
このように、ＴＡＬＥＮやＺＦＮといった従来例と原核生物起源のＣ
ＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系は関連性の低い技術である。
イ 核局在化シグナルの付加の点について
細胞環境
引用発明の系の環境は、真核生物細胞の環境とは本質的に異なる。す
なわち、本願第１優先日当時、核内移行シグナル（核局在化シグナル）を利用してポリペプチドを真核生物の核内に移行させる技術は知られていたものの、その技術を採用することが動機付けられるのは、ポリペプチドを核内に移行させ何らかの作用を奏させることが可能であることを前提とする。そうすると、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系は、核内に移行し、そこでガイドＲＮＡと複合体を形成しなければその作用を奏しないから、核局在化シグナルをＣａｓ９ポリペプチドに付することが動機付けられるためには、Ｃａｓ９ポリペプチドが核内に移行できるだけでなく、核内でガイドＲＮＡと複合体を形成できることが想定される必要がある。原核生物に起源する新しいシステムにおいて、Ｃａｓ９ポリペプチドが核内に移行できるか否か、核内に移行したＣａｓ９ポリペプチドとガイドＲＮＡとが機能可能に正確な複合体を形成し、さらに、引用文献１のようなｉｎｖｉｔｒｏ（生体外）の系と同様に標的ＤＮＡを切断する機能を示すことができるかは、当業者であっても予測できたものではない。このように、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系は、Ｃａｓ９ポリペプチドが核内に移行するだけでなく、核内でガイドＲＮＡと複合体を形成しないと機能しない点で、ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮとは根本的に異なるものであるから、単にＣａｓ９ポリペプチドが核内に移行できさえすればよいというものではない。
サイズの相違
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系とＴＡＬＥＮ及びＺＦＮとの間には、その
サイズに大きな違いが存在し（甲８９）、このようなサイズの違いから、当業者は、ＺＦＮやＴＡＬＥＮにおいて核局在化シグナルの使用が動機付けられたからといって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系においても同様に核局在化シグナルを用いることが動機付けられた、あるいは、当業者がその適用を創意工夫なくなし得たとはいえない。すなわち、従来技術とされるＴＡＬＥＮ（分子量１０５ｋＤ以下）やＺＦＮ（分子量４０ｋＤ以下）と比較すると、Ｃａｓ９ポリペプチド（分子量１６３ｋＤ）は、そのタンパク質サイズが大きく、その分子の形状についてみても、Ｃａｓ９ポリペプチドは球状構造であるのに対して、ＴＡＬＥＮ及びＺＦＮは単純な反復構造（比較的伸びた形状）を有するものにすぎない。そして、タンパク質は、核膜の穴を通して核内へと移行することが想定されるところ、ＴＡＬＥＮやＺＦＮと比較して顕著にサイズが大きいＣａｓ９ポリペプチドが、これらの従来技術と同様に、核膜を通過して核内へと移行することが当然に想定できるわけではない。
「容易の容易」
当業者が、相違点１に係る構成を想到して本願発明の構成に至るため
には、まず、①原核細胞を対象とした引用発明について、対象を真核細胞へと変更することを想到し、この構成の変更を前提にして、次に、②タンパク質の核内移行手段として核局在化シグナルを用いる、という２つのステップを踏む必要がある（いわゆる「容易の容易」）。そして、このように主引用発明から２つの段階を経てようやく相違点の構成に至るような発明は、当業者にとっては通常格別な努力を必要とするものであるから、容易には発明できないとして、進歩性が認められるべきである。⑵予測できない顕著な効果に関する判断の誤り
本願発明の有利な効果は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系が真核細胞においてゲノムＤＮＡを切断することができたという点にあり、これ自体が本願第１優先日当時の公知技術と比較して驚くべき効果であり、本願第１優先日当時の技術水準の下で当業者が予測することができたものではない。そして、引用文献１は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系が真核細胞において機能し得ることすら実証又は示唆するデータを開示しておらず、まして、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系が真核細胞内で有利に標的特異性を有する可能性について示唆もしていない。そのため、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を真核細胞において成功裏に用いることができたこと自体が、本願第 1 優先日当時の刊行物の記載及び技術水準から予測可能なものではなく、本願発明の従来技術に勝る有利な効果である。本願発明は、治療剤の開発において新世界を開く効果があり、その技術的、商業的価値は多大なものである。現に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を用いてヒト細胞（真核細胞）のＤＮＡを切ることができるという実験が成功したときに世界が熱狂し、注目したことは周知の事実である。このように、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を真核細胞系に適用することが可能であると示されたことによってゲノム編集技術への応用可能性が格段に広まり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系は様々な場面で幅広く用いられることとなった。このこと自体が本願発明の顕著な作用効果として認定されるべきものである。その後のゲノム編集技術の発展をみても、本願発明は、画期的であり革新的なブレイクスルー発明である。
２ 被告
⑴相違点１の容易想到性の誤りの主張について
ア 真核細胞における標的ＤＮＡに適用する点について
阻害要因について
引用発明は、Ⅱ型Ｃａｓ９タンパク質と、天然では別個に存在するｃ
ｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとを人工的に融合してなるキメラＲＮＡとを含む、人工物たるＣａｓ９ポリペプチドを含む「プラスミド中の標的ＤＮＡを緩衝液中で切断するための組成物」であって、天然（原核細胞）のＣａｓ９ポリペプチドをそのまま含むものではない。また、切断の対象は、「緩衝液中」に存在する「プラスミド（環状二本鎖ＤＮＡ）中の標的ＤＮＡ」である。そうすると、引用発明は天然の原核細胞と関係はなく、原告が主張する真核細胞と原核細胞の相違は、そもそも、引用発明を真核細胞に適用することの阻害要因たり得ない。
そして、原告が阻害要因として指摘する点は、当業者の誰もが求める
真核細胞における優れたゲノム編集ツールを、開発を試みることもなくこれを断念させるようなものではない。実際のところ、本願発明の発明特定事項には、原告が阻害要因として指摘する点を回避するための創意工夫は含まれていないし、実施例をみても、原告が阻害要因として指摘する点に着目してそれを回避するための検討を行っていたことをうかがわせる記載は見いだせない。
ａ 阻害要因１について
本件審決が認定した引用発明は、「（ａ）Ⅱ型Ｃａｓ９タンパク質」
自体を含んでおり、これは、「プラスミド中の標的ＤＮＡを緩衝液中で切断するため」に、当然、正しく折り畳まれたものであるから、「Ｃａｓ９タンパク質」に関して、本願発明の「（ⅰ）核局在化シグナルを有するＣａｓ９ポリペプチド」と引用発明の「（ａ）Ⅱ型Ｃａｓ９タンパク質」との相違部分は、「核局在化シグナル」を有しているか否かだけである。したがって、原告が主張する阻害要因１は、相違点１とは関
係がないものであり、その主張は前提において誤りである。
また、仮に、阻害要因１が、本願発明のうち、「（ⅰ）Ｃａｓ９ポリ
ペプチドおよび核局在化シグナルをコードする核酸」の場合について
の主張であるとしても、次のとおり、その主張は失当である。
すなわち、分解等の懸念があるのであれば、核酸の導入量を増やす
など、当業者は、実験条件の最適化を当然行う。しかも、本願第１優
先日までに、原核細胞に由来するタンパク質を真核細胞中で機能的に
発現させた例は枚挙するにいとまがない。古くは１９９６年に、原核
細胞（大腸菌）に由来し、ＤＮＡに作用するタンパク質であるＲｅｃ
Ａを、本願発明と同様に、核局在化シグナルを付加した形で真核細胞
（植物細胞）内において発現したところ、核内に移行し、植物細胞ゲ
ノムＤＮＡに対して正常な機能を発揮したことが報告されている（乙
２０の３０９４頁右欄２０ないし３３行目）。
本願発明も、真核細胞内でＣａｓ９ポリペプチドを正常に発現し、
折り畳み、分解されないようにするための発明特定事項は含んでいな
いし、実施例にも、Ｃａｓ９ポリペプチドを正常に発現し、折り畳み、分解されないようにするための創意工夫は何ら認められない。本願発
明は、Ｃａｓ９ポリペプチドをＲｅｃＡなどと同様に誰もが望む真核
細胞で発現させてみたところ、予想どおり、何らの問題もなく、正常
に発現され、折り畳まれて、機能が発揮されたというだけのことであ
る。
ｂ 阻害要因２について
仮に、ガイドＲＮＡがヌクレアーゼによって分解等される懸念があ
るのであれば、ガイドＲＮＡの導入量を増やすなど、当業者は、実験
条件の最適化を当然行う。
本願発明も、真核細胞環境内でガイドＲＮＡが分解されないように
するための発明特定事項は含んでいないし、実施例にも、ガイドＲＮ
Ａを分解から保護するための創意工夫は何ら認められない。本願発明
でも、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を真核細胞に導入したところ、予想
どおり、ガイドＲＮＡも含めて特段の問題もなく存在し得て、機能が
発揮されたというだけのことである。
ｃ 阻害要因３について
当業者であれば、引用発明を真核細胞に適用することを想起しただ
けで、自ずと常套手段である核局在化シグナルの付加を導き出し、こ
れによりＣａｓ９ポリペプチドがガイドＲＮＡと複合体を形成するこ
とを当然予測し得た。
本願発明も、Ｃａｓ９ポリペプチドを核内へ移行させるための手段
として、核局在化シグナルを付加すること以外の発明特定事項は含ん
でいないし、実施例にも、核局在化シグナル以外の創意工夫は何ら認
められない。本願発明でも、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系に真核細胞の
核内移行における常套手段を適用したところ、予想どおり、何らの問
題もなく核内に移行して機能を発揮したというだけのことである。
ｄ 阻害要因４について
本願第１優先日当時、既に、クロマチンの存在にもかかわらず外来
タンパク質が真核細胞の核内のゲノムＤＮＡに作用した数多の例が知
られていた。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系と同様に原核細胞に
由来するＲｅｃＡ（乙２０）や、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系と同様に
ゲノム編集ツールとして周知のＺＦＮ（甲２１、２２、２５、２６、
乙７）やＴＡＬＥＮ（甲２３、２４、３０、乙７）である。
本願発明も、クロマチンの存在による悪影響を低減させるための発
明特定事項は含んでいないし、実施例にも、クロマチンの存在による
悪影響を低減させるための創意工夫は何ら認められない。本願発明で
も、ＲｅｃＡ、ＺＥＮ及びＴＡＬＥＮ等の先例から予想されるとおり、クロマチンによる悪影響はなかったというだけのことである。
ｅ 阻害要因５について
本願第１優先日前に、既に、ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮで真核細胞ゲノ
ムにおける標的配列を切断することが広く知られていたところ（甲２
１ないし２６）、これらのゲノム編集ツールが、サイズの大きなゲノムを対象とする場合に標的配列へのアクセスが不可能となったり、困難
を伴うとの事情があったとは認められない。また、各ゲノム編集ツー
ルの標的配列の長さに着目すると、ＺＦＮは、１８ないし３６塩基対、ＴＡＬＥＮは、２４ないし４０塩基対であって（甲９０）、いずれも、真核細胞ゲノム中でこのような長さの標的配列にアクセスし、切断す
ることができていたものである。これに対して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａ
ｓ９系の標的配列の長さは、１７ないし２３塩基対程度であって（甲
２０の８２０頁図５Ａ、甲９０）、ＺＦＮやＴＡＬＥＮの標的塩基対と同程度なのだから、当業者は、真核細胞ゲノムが大きいためにＣＲＩ
ＳＰＲ／Ｃａｓ９系が標的配列を探し当てられないとか、アクセスで
きないなどとは考えない。
本願発明も、サイズの大きな真核細胞ゲノム中の標的にアクセスす
るための発明特定事項は含んでいないし、実施例にも、真核細胞ゲノ
ムの大きさを克服して標的にアクセスするための創意工夫は何ら認め
られない。本願発明でも、ＺＦＮやＴＡＬＥＮの先例から予測される
とおり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系が真核細胞ゲノム中の標的配列に
アクセスしてその場で切断することができたというだけのことである。
ｆ 阻害要因６について
グループⅡイントロンシステムはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系とは別
物であって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系と関連性の薄い事例にすぎな
い。
本願発明は、真核細胞中のマグネシウムイオン濃度に対応するため
の発明特定事項は含んでいないし、実施例にも、真核細胞中のマグネ
シウムイオン濃度に対応するための創意工夫は何ら認められない。本
願発明は、引用発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を真核細胞中に移し
たところ、そのまま機能し得たというだけのものにすぎない。
ｇ 阻害要因７について
オフターゲットＤＮＡ配列への結合可能性は、ＤＮＡ結合ドメイン
の特異性の程度に依存し、従来から使用されていたＺＦＮ及びＴＡＬ
ＥＮでも同様に留意される切断特異性の問題である。そして、オフタ
ーゲット切断であれ、オンターゲット切断（本来の標的配列の切断）
であれ、ＤＮＡが切断されても、細胞はＤＮＡ修復機構を有しており、死滅するわけではないのだから、オフターゲット結合やオフターゲッ
ト切断の懸念が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を真核細胞に適用するこ
とを妨げるはずはない。
本願発明は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系によって生じる可能性があ
る細胞毒性を回避するための発明特定事項は含んでいないし、実施例
にも、そのための創意工夫は何ら認められない。本願発明は、引用発
明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を真核細胞中に移したところ、そのま
ま機能し得たというだけのものにすぎない。
本願第１優先日当時における当業者の認識及び技術常識について
ａ 原告が前記１⑴アａにて示した例（Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、
グループⅡイントロンシステム、リボスイッチ、リボザイム）は、い
ずれもＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系とは関連性の薄い技術であって、引
用発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を真核細胞に適用することの強い
動機付けを阻害するほどの事情ではない。むしろ、真核細胞に由来し
ないシステムを真核細胞において機能させる試みが数多く存在すると
いう事実は、真核細胞で機能させることが望まれるシステムはその由
来にかかわらず真核細胞に導入してみることが、当業者にとっていか
に自然な発想であるかを如実に示している。
ｂ 甲第４８号証には、当業者がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系をＺＦＮやＴＡＬＥＮに替わる真核細胞のゲノム編集ツールとして期待を寄せ、
実際に適用したことが示されており（甲４８の１頁要約、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、訳文は乙２１）、甲第４９号証には、引用文献１の発行直後に当業者がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系の真核細胞への適用に取りかかってい
たことが示されており（甲４９の４頁左欄６行目ないし右欄４行目、
訳文は乙２２）、甲第３７号証には、引用文献１に接した当業者が速やかに植物や動物といった真核細胞に適用したことが示されており（甲
３７の２頁２４ないし３１行目、訳文は乙２３）、甲第８７号証には、引用文献１のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系が、引用文献１発行直後に真
核細胞に適用されたことが紹介されており（甲８７の１頁本文１４な
いし２３行目、訳文は乙２４）、甲第４１号証には、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を真核細胞に適用することを強く推奨し、その成功が期待で
きることが示されている（甲４１の１６５８頁中欄１０ないし１４行
目、１６６０頁右欄５ないし６行目、同頁右欄２６ないし３０行目、
訳文は乙２５）。
ｃ 甲第４１、第４８及び第４９号証は、引用文献１の影響力の大きさを裏付けるとともに、数多くの当業者グループが、独立に、しかし、
まるで示し合わせたかのように、引用文献１の発行直後にＣＲＩＳＰ
Ｒ／Ｃａｓ９系を真核細胞に適用し始めたことを示すものである。
ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮとＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ポリペプチドとの相
違について
引用発明は、本来的に原核細胞を対象とした技術ではなく、ＣＲＩ
ＳＰＲ／Ｃａｓ９系が天然の原核細胞で見いだされたことは、もはや
引用発明とは関係のないことなのだから、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系
が原核細胞由来であることから真核細胞に適用することが困難とする
原告の主張は、前提において誤りがある。引用発明のＣＲＩＳＰＲ／
Ｃａｓ９系のＲＮＡ成分である「（ｂ）ｃｒＲＮＡの３′末端側にｔｒａｃｒＲＮＡの５′末端側が融合したキメラＲＮＡ」（原告の主張においては「ｇ（ガイド）ＲＮＡ」。）は、自然界に存在するｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとを人工的に融合して単純化したものであって、自
然状態において原核細胞で生じるものではない。
しかも、それぞれのＤＮＡ結合ドメインを比べてみると、ＺＦＮで
は、１モジュールのタンパク質が３塩基の標的配列を認識して結合し、ＴＡＬＥＮでは、１モジュールのタンパク質が１塩基の標的配列を認
識して結合し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系では、１塩基のＲＮＡが１
塩基の標的配列を認識して結合するから（乙７の９頁図１）、いずれのＤＮＡ結合ドメインにしても、ＤＮＡという物質に直接作用して、き
わめて機械的な機序で標的配列を認識して切断する活性を有するにす
ぎない。そして、ＺＦＮやＴＡＬＥＮのＤＮＡ結合ドメインが、真核
細胞のクロマチン環境に特化した構造や標的配列認識機構を有してい
るわけではないし、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系のＤＮＡ結合ドメイン
が原核細胞のＤＮＡしか認識できないわけでもない。
また、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系が標的配列に結合するに際して標
的ＤＮＡの二重らせん構造の開放を行うという点は、ＣＲＩＳＰＲ／
Ｃａｓ９系がＤＮＡ（二重らせん構造を有することは自明である。）の標的配列に結合してその場でＤＮＡを切断する以上は、引用文献１自
体に示されていることであり、引用発明の真核細胞への適用を妨げる
ことはない。
イ 核局在化シグナルの付加の点について
核局在化シグナルを付加することは、ポリペプチドを核に送達するた
めの常套手段であって、引用発明を真核細胞に適用することを想起しただけで自ずと導き出される常套手段にすぎない。実際、引用文献１の発行からわずか数か月のうちに、数多の研究グループが、独立して、一斉に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使って真核細胞のゲノム編集を行ったところ、それらの全てにおいて、例外なく、核局在化シグナルが付加されていたというのが、本願第１優先日当時の実情である。
細胞環境について
核局在化シグナルとは、細胞核の中で働くタンパク質が細胞質で合成
された後、核内にまで能動的かつ選択的に輸送されるために必要な数個ないし十数個のアミノ酸からなる配列をいう（乙４）。真核細胞内において、核局在化シグナルを有する物質は、核膜に存在する小さな核膜孔を、シャッターのように直径約１００ｎｍに開いて、核内へと通過する（乙２９、３０）。また、直径９ｎｍ程度（ガイドＲＮＡは優にこれを下回る。）より小さな物質は、核局在化シグナルがなくとも、小さな核膜孔を自由に通過する（乙３０）。Ｃａｓ９ポリペプチド（約１６３ｋＤａ）のようなタンパク質の大きさは、せいぜい数ｎｍ程度である（乙３１ないし３３）から、核局在化シグナルを有してさえいれば、そのまま、直径約１００ｎｍに開口した核膜孔を通過して、核内へと移行する。
サイズの相違について
核局在化シグナルは、核内へ移行するための必要かつ十分な活性をも
つものであって、それさえ有していれば、約１７０ｋＤａのＭＴａｓｅ（ＤＮＡシトシン―５―メチルトランスフェラーゼ）（乙３４）、約１８５ｋＤａのトポⅡ（ＤＮＡトポイソメラーゼⅡ）（乙３５）、約２３９ｋＤａのＳｅｎ１ｐ（乙３６）といった、Ｃａｓ９ポリペプチド（約１６３ｋＤａ）を上回るサイズのタンパク質のみならず、桁違いに大きく複雑な巨大複合体であるウイルス粒子でさえ、核膜孔を直径約１００ｎｍに開口して通過することが広く知られていた（乙３７）。直径約１００ｎｍに開口した核膜孔と比べて、数十ないし数百ｋＤａ程度のタンパク質は十分小さく、その形状が核膜孔の通過しやすさに影響するとは到底考えられない。
したがって、Ｃａｓ９ポリペプチドのサイズや形状は、核局在化シグ
ナルを付加することを妨げる理由にはならない。
「容易の容易」について
本件審決は、核局在化シグナルの付加は、引用発明のＣＲＩＳＰＲ／
Ｃａｓ９系を真核細胞に適用することを想起しただけで、何らの創意工夫もなく導き出される程度のことにすぎないとしたものであって、いわゆる「容易の容易」に当たらないことは、本件審決の文言上明らかである。
⑵予測できない顕著な効果に関する判断の誤りについて
本願発明の効果は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系が真核細胞において標的ＤＮＡを切断することができたというものであるが、これは、まさに、引用発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を真核細胞に適用することを想起すると同時に当然想定される結果にすぎず、効果の顕著性など見いだす余地もない。
第４ 当裁判所の判断
１ 本願発明について
本願明細書には、別紙１「本願明細書の記載事項（抜粋）」のとおりの記載があり、この記載によると、本願発明について、次のような開示があると認められる。
⑴技術分野
本願発明は、真核細胞又は真核生物における標的化ゲノム編集に関するに関するものである（【０００１】）。
⑵背景技術
ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された規則的間隔の短いパリンドローム反復配列、ＣｌｕｓｔｅｒｅｄＲｅｇｕｌａｒｌｙＩｎｔｅｒｓｐａｃｅｄＳｈｏｒｔＰａｌｉｎｄｒｏｍｉｃＲｅｐｅａｔ）は、配列決定された細菌の約４０％及び配列決定された古細菌の９０％のゲノムにおいて見出される多数の短い直列反復配列を含む遺伝子座であるが、原核生物の免疫系として機能する（【０００２】）。タイプⅡＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに必須のタンパク質成分であるＣａｓ９ポリペプチドは、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と呼ばれる２つのＲＮＡと複合体を形成した場合、活性を有するエンドヌクレアーゼを形成し、それによって侵入したファージ又はプラスミド中の外来遺伝因子を切断して、宿主細胞を防御する（【０００３】）。近年、【Ａ】ら（１）は、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの必須部分の融合によって産生された一本鎖キメラＲＮＡがＣａｓ９／ＲＮＡ複合体中の２つのＲＮＡと置き換え可能であり、機能的なエンドヌクレアーゼを形成できることを実証した（【０００３】）。
ヌクレオチド結合ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質における部位特異性は、設計及び合成がより困難であり得るＤＮＡ結合タンパク質の代わりに、ＲＮＡ分子に支配されているので、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ジンクフィンガー及び転写活性化因子様エフェクターＤＮＡ結合タンパク質に対して利点を提供する（【０００４】）
⑶発明が解決しようとする課題
今まで、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに基づくＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）を用いたゲノム編集法は開発されていなかったところ、本願発明は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに基づくゲノム編集法であり、真核細胞及び真核生物において標的化してＤＮＡを切断するプログラム可能なＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを開発したものである（【０００４】、【０００６】）。
⑷課題を解決するための手段
本願発明の目的は、標的ＤＮＡに特異的なガイドＲＮＡ若しくはガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ、及びＣａｓタンパク質コード核酸若しくはＣａｓタンパク質を含有する、真核細胞又は真核生物中の標的ＤＮＡを切断するための組成物を提供することである（【０００７】）。
⑸発明の効果
本願発明は、新しい便利なゲノム編集ツールを提供する（【００２１】）。⑹発明を実施するための形態
ア 本願発明より前に、Ｃａｓタンパク質のエンドヌクレアーゼ活性は知られていたが、真核生物のゲノムの複雑さのため、Ｃａｓタンパク質のエンドヌクレアーゼ活性が真核細胞中で機能するかどうかは知られていなかった（【００２５】）。ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮと比較して、Ｃａｓタンパク質に基づく本願発明の組成物は、合成ガイドＲＮＡ成分が置き換えられるだけで新たなゲノム編集ヌクレアーゼを作製できるため、より容易にカスタム化され得る上、オフターゲット作用を持たないため、望ましくない突然変異、欠失、逆位、及び重複を引き起こさない特性を有することから、真核細胞及び真核生物におけるゲノム工学のための拡張性のある、汎用的で便利なツールとなる（【００２６】）。
イ Ｃａｓの遺伝子及びタンパク質に関する情報は、国立生物工学情報センター（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、ＮＣＢＩ）のＧｅｎＢａｎｋから、制限なく利用できる（【００２７】）。３種類のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムが存在し、そのうち、Ｃａｓ９タンパク質並びにｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含むタイプⅡＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが代表的であり、よく知られている（【００２８】）。
ウ 本願発明の組成物は、タンパク質の形態で、又はＣａｓタンパク質をコードする核酸の形態で、Ｃａｓ成分を含有しうるものであり、Ｃａｓタンパク質は、ガイドＲＮＡと複合体を形成した際、それがエンドヌクレアーゼ活性又はニッカーゼ活性を有する限り、任意のＣａｓタンパク質であり得る（【００２９】）。
エ 本願発明では、ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）で構成され、又はｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの必須部分の融合によって作製される一本鎖ＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）やｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含むデュアルＲＮＡであり得、ガイドＲＮＡがｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの必須部分並びに標的と相補的な部分を含むならば、任意のガイドＲＮＡが本願発明において使用され得る（【００３３】）。
オ ガイドＲＮＡは、ＲＮＡ又はガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ（核酸）の形態で、細胞又は生物に移入され得る（【００３５】）。
２ 取消事由（引用発明に基づく本願発明の進歩性判断の誤り）の有無について⑴相違点１の容易想到性判断の誤りの有無について
ア 引用発明１について
引用文献１には、別紙２「引用文献１の記載事項（抜粋・訳文）」のとおりの記載があり（訳は、甲２０添付訳文及び乙８による。）、①クラスター化され、規則的に間隔が空いている短い回文の反復（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）系を構成するｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡに基づいて設計されたキメラＲＮＡとⅡ型Ｃａｓ９タンパク質とにより、プラスミド中の、キメラＲＮＡと塩基対を形成する標的ＤＮＡが、緩衝液中で切断されることを実験により確認したこと、②当該キメラＲＮＡが、ｃｒＲＮＡの３′末端側にｔｒａｃｒＲＮＡの５′末端側を融合させたものであることが記載されており、これら記載によると、引用発明として、本件審決が認定するとおりのものを認定することができ、この点は、当事者間にも争いがない。
イ 相違点１について
本願発明の組成物と引用発明の組成物とを対比すると、相違点として、本件審決が認定するとおりの相違点１及び２を認定することができ、この点は、当事者間にも争いがない。
ここで、原告は、相違点１を「本願発明は、「真核細胞」における標的ＤＮＡを切断するための組成物であるのに対して、引用発明は、「緩衝液中」の標的ＤＮＡを切断するための組成物である点」（以下「相違点１Ａ」という。）と「本願発明は、Ｃａｓ９ポリペプチドが「核局在化シグナル」を有しているのに対して、引用発明は、Ｃａｓ９ポリペプチドが「核局在化シグナル」を有していない点」（以下「相違点１Ｂ」という。）とに分けてその容易想到性を論じているから、当裁判所も、ひとまず便宜的にこれに従い、以下、判断を加える。
相違点１Ａについて
引用文献１には、「クラスター化され、規則的に間隔が空いている短い回文の反復（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）系」のｃｒＲＮＡとトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）が塩基対になって形成されるデュアル－ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡが、Ｃａｓ９ポリペプチドに標的ＤＮＡの二本鎖切断を指示することが記載され、その上で、「このデュアル－ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡは、一本鎖ＲＮＡキメラとして設計されたときも、配列特異的に、Ｃａｓ９による二本鎖ＤＮＡ切断を誘導する。私たちの研究は、部位特異的ＤＮＡ切断のためにデュアル－ＲＮＡを使用するエンドヌクレアーゼのファミリーを明らかにし、ＲＮＡでプログラム可能なゲノム編集のためにこのシステムを利用する可能性を強調する。」と記載されている（８１６頁要約）。そして、引用文献１には、引用発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に関して、「ゲノム標的化及びゲノム編集のための・・・システムを開発することができるという刺激的な可能性を示している。」（８１６頁中欄３５行目ないし右欄３行目）及び「プログラムされたＤＮＡ切断及びゲノム編集において潜在的に有用であるため、魅力的である。」（８２０頁左欄２ないし５行目）とも記載されている。さらに、引用文献１には、「ジンク－フィンガーヌクレアーゼや転写活性化様エフェクターヌクレアーゼは、ゲノムを操作するために設計された人工酵素として、大きな関心を集めた。私たちは、遺伝子ターゲティングとゲノム編集への応用に向けた大きな潜在能力をもたらし得るＲＮＡによりプログラムされたＣａｓ９に基づく代替的な手法を提案する。」（８２０頁右欄２ないし９行目）と記載されている。
これらの記載からみて、引用文献１には、引用発明１のＣＲＩＳＰＲ
／Ｃａｓ９系がゲノム編集に有用であろうことが示唆されており、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系はゲノムを操作するために設計された人工酵素であるＺＦＮやＴＡＬＥＮに替わり得る新たなゲノム編集の手段として提案されていたと認められる。
一方、本願第１優先日当時、ゲノム編集の主たる対象は真核細胞であ
って、ＺＦＮやＴＡＬＥＮが真核細胞中の標的ＤＮＡすなわち核内のゲノムを切断するものであることは技術常識である（甲２１の１４６４頁３４ないし３６行目、甲２２の３３９頁右欄１５行目ないし３４０頁左欄１６行目、甲２３の１４３頁右欄８ないし１３行目、甲２４の２頁右欄３５ないし４０行目、甲２５の１[００６４］〔訳は甲２５の２【００６４】による。〕、甲２６の１［ＣＬＡＩＭ３］、［００７５]ないし［００７８］〔訳は甲２６の２【請求項３】、【００７５】ないし【００７８】による。〕）。
また、本願第１優先日当時、タンパク質や核酸を真核細胞へ送達する
各種手段は周知技術である（甲２５の１［００６８］〔訳は甲２５の２【００６８】による。〕、甲２６の１[００７５]、[０１０４]、[０１０５]〔訳は甲２６の２【００７５】、【０１０４】、【０１０５】による。〕）。これらの点を踏まえれば、引用文献１の記載に接した当業者は、引用
文献１にいう「ゲノム編集」は「真核細胞」におけるゲノム編集をも意図するものと認識し、本願第１優先日当時の周知技術に基づいて、引用発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を、真核細胞のゲノム上の標的ＤＮＡの切断に用いようと試みるものといえる。
相違点１Ｂについて
真核細胞のゲノムが核内に存在することは当業者にとって自明の事項
であるところ、タンパク質を真核細胞の核内に移行させるために核局在化シグナルを付加することは、本願第１優先日当時の常套手段である（甲２４の２頁図１、甲２５の１［００３９］〔訳は甲２５の２【００３９】による。〕、甲２６の１[００８５]〔訳は甲２６の２【００８５】による。〕、甲２７の２３頁２７行目ないし２４頁６行目、甲２８【請求項１】、甲２９【０１４７】）。
そうすると、上記のとおりに引用発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系
を真核細胞のゲノム上の標的ＤＮＡの切断に用いようと試みる当業者は、Ｃａｓ９ポリペプチドに核局在化シグナルを付与することを常套手段として当然に行うと認められるから、核局在化シグナルの付与に独自の創意工夫を挟ませる余地はないといえる。
小括
以上からすると、相違点１は容易に想到できるといえる。
ウ 原告の主張について
原告は、前記第３の１⑴アのとおり、引用発明を真核細胞へ適用する際の阻害要因（同）、本願第１優先日当時の当業者の認識及び技術常識（同）、又は引用発明とＺＦＮ及びＴＡＬＥＮといった従来技術との相違（同）から、引用発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を真核細胞の核内のゲノムに対して機能させようと試みることは動機付けられない旨主張する。本願発明と引用発明とは、引用発明のＣａｓ９ポリペプチドが「核局在化シグナル」を有していない点（相違点１Ｂ）を除き、①物としての構成、すなわち、（ⅰ）Ｃａｓ９ポリペプチドと（ⅱ）ｃｒＲＮＡ配列がｔｒａｃｒＲＮＡ配列に対して５′末端側に融合し、標的ＤＮＡにハイブリダイズするガイドＲＮＡを含むキメラガイドＲＮＡを含む組成物であるという点で一致し、②用途としての構成、すなわち、標的ＤＮＡを切断するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系である点で一致する。そして、真核細胞に適用するための単なる常套手段である上記相違点１Ｂ以外、本願発明が真核細胞における標的ＤＮＡを切断するための組成物である点（相違点１Ａ）に関して、そのような用途に用いるについて本願発明が特徴的な構成を有することは原告から何も主張されておらず、実際、本願発明の構成から、引用発明の構成に加えて、そのような特徴的な構成のための限定あるいは付加をうかがうことはできない。そうすると、本願発明の構成を前提とする限り、本願発明は、引用発明のＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９系を常套手段を用いて真核細胞に適用できることを確認したにすぎないものである。
したがって、なおも本願発明の構成を前提としてこれが容易想到であるとはいえないというためには、本願発明が真核細胞における標的ＤＮＡを切断するための組成物である点（相違点１Ａ）について、引用発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を真核細胞に適用しようと試みることは動機付けられないとする特別な事情が必要である。
以下、このような観点から、原告において本願発明が容易に想到できるとはいえないことを基礎付けると主張する阻害要因等について検討する。阻害要因について
原告は、前記第３の１⑴アのとおり、本願第１優先日当時の当業者の
認識として、①Ｃａｓ９ポリペプチドのように真核細胞内に本来的に存在しないタンパク質は、真核細胞内では、不適切なフォールディングにより活性を失うか、ユビキチン経路と呼ばれる真核細胞に存在するタンパク質分解経路によって認識されて分解されることが想定された（阻害要因１）、②ガイドＲＮＡがＣａｓ９ポリペプチドと複合体を形成するよりも前に真核細胞性のヌクレアーゼによって分解されたり、分子シャペロンがガイドＲＮＡに結合して機能性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系が形成されるのが邪魔されることが想定された（阻害要因２）、③Ｃａｓ９ポリペプチドが、真核細胞の細胞質から核へと移動し、次いでガイドＲＮＡを見つけ出しそれと機能可能な正しい複合体を形成することができないことが想定された（阻害要因３）、④真核細胞のゲノムＤＮＡが高度に折り畳まれているクロマチンによってＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系の使用が阻まれることが想定された（阻害要因４）、⑤ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系がゲノムサイズの大きな真核細胞ゲノムについて標的配列ではないＤＮＡ配列を切断してしまうことが想定された（阻害要因５）、⑥低濃度のマグネシウムイオン環境である真核細胞においては、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体を適用してＤＮＡを切断することはできないことが想定された（阻害要因６）、⑦ガイドＲＮＡを真核細胞に導入することに伴う細胞毒性があることが想定された（阻害要因７）ことが阻害要因となる旨、るる主張する。
しかしながら、原告の上記主張は、原核細胞と真核細胞の相違から、
引用発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を真核細胞に適用する際に生じ得る事象の一般的・抽象的な可能性又は懸念を述べるにとどまるものであって、具体的にこれら事象が生じることが確認されていたことを示すものではないから、引用発明を真核細胞に適用するに際する障害として、引用発明の構成から具体的に克服しなければならない課題を述べるものとはいえない。
したがって、上記のような一般的・抽象的な可能性又は懸念をもって、引用発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を真核細胞に適用しようと試みることが動機付けられない特別の事情に当たるとはいえず、むしろ、前記
イ のとおり、引用文献１に接した当業者は、当然に、ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９系を真核細胞に適用しようと試みるものといえる。
したがって、原告主張の上記各阻害事由は、本件結論を左右し得るも
のではない。
当業者の認識及び技術常識について
原告は、前記第３の１⑴アａないしｃのとおり、①本願第１優先日
当時、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、グループⅡイントロンシステム、リ
ボスイッチ、リボザイムのように真核細胞由来ではないシステム及び遺伝子を真核細胞において機能させる数々の試みが失敗してきた、②当業者はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系が真核細胞内で機能し得ることについては専ら否定的な見解を有していた旨主張する。
しかしながら、原告の指摘内容からしても、Ｔ７ＲＮＡポリメラー
ゼ、グループⅡイントロンシステム、リボスイッチ、リボザイムは、真核細胞由来ではないシステムという限度でＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系と関連するのにとどまり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系とは関連性の薄い技術に関するものにすぎず、少なくとも、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ等の
前記技術を真核細胞に適用することに失敗した例を報告する論文があったとしても、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を真核細胞に適用することを試みることを妨げるものとはいえない。
また、本願第１優先日当時の当業者の認識等について、原告は、前記
第３の１⑴アｂのとおり、本願第１優先日前後に刊行された各文献に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系が真核細胞内で機能し得ることについて否定的な記載がある旨主張するが、これらの記載は、真核細胞への適用に当たり解決すべき課題として当業者が認識していたものを具体的に明らかにするものではない。かえってこれらの文献には、「真核細胞において部位特異的ＤＮＡ切断をするための代替手段は、非常に興味深い。」（甲４８の１頁Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ６ないし８行目、訳は乙２１による。）、「【Ｄ】は、『私の研究室は、どのようにすればＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９が真核細胞において適切に機能するかについて探索を始めた』と述べた。『その間、ハーバード大学の【Ｅ】やＭＩＴの【Ｆ】の研究グループもまた、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９が真核細胞において機能し得るかを確認するため、懸命に作業を行っていた』。」（甲４９の２０頁左欄１３ないし１７行目。訳は乙２２による。）、「単一のプログラム可能なＲＮＡ鎖のみを必要とするようにシステムを設計できるとしたらどうだろうか。そうすると、生物学者はそれを使用して任意のＤＮＡ配列を簡単に標的化して切断することができる。【Ｄ】は『興奮の寒気』を感じた。」（甲３７の２頁２６ないし２８行目。訳は乙２３による。）、「先週サイエンス誌速報に発表された２つの新しい論文は、この技術がヒト細胞でも作用することを示した。ヒト細胞での同様の成功を報告する【Ｄ】らの論文は新しいオープンアクセスなｅＬｉｆｅ誌で発行されることが受理された。」（甲８７の１頁２０ないし２３行目。訳は乙２４による。）、「【Ａ】らによる新しい研究は、特定のゲノム配列を標的とすることができる試薬の設計のための、新しいアプローチ―最も原始的なＤＮＡ認識に基づく―を提供した」（甲４１の１６５８頁中欄１０ないし１４行目。訳は乙２５による。）、「このシステムを真核細胞に適用する試みだけが、これらの懸念を払拭するであろう。」（甲４１の１６６０頁右欄５ないし６行目。訳は乙２５による。）、「ＣＲＩＳＰＲシステムが、標的切断手法の次の次の世代を提供するかどうかはまだわからないが、試す価値があることは明らかである。乞うご期待。」（甲４１の１６６０頁右欄２６ないし３０行目。訳は乙２５による。）とあるように、当業者は、原核細胞と真核細胞の違いを認識しつつも、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を真核細胞に適用することを試みる価値のある有望なものと認識していたものであって、実際に、本願第１優先日当時、複数の研究機関がその適用を試みており（甲３５、３６、４８、４９、乙１５）、むしろ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系の真核細胞への適用を試みることには当業者にとって何ら障害のあるものではなかったというべきである。
以上のとおりであるから、原告の上記主張を採用することはできない。ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮとＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系との相違について
原告は、前記第３の１⑴アのとおり、ＺＦＮやＴＡＬＥＮはＣＲＩ
ＳＰＲ／Ｃａｓ９系のようにＲＮＡと複合体を形成するような構造ではないことから、ＺＦＮやＴＡＬＥＮといった従来技術の活用例から、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を真核細胞へと適用することの動機付けを見いだすことはできない旨主張する。
しかしながら、原告の指摘内容にあるとおり、ＺＦＮは、真核細胞の
ゲノムＤＮＡ配列に結合するジンクフィンガーモジュールと細菌由来のゲノムＤＮＡ配列を切断する機能を有するＦｏｋ１酵素とからなり、ＴＡＬＥＮは、真核細胞である植物細胞のゲノムＤＮＡ配列に結合するＴＡＬエフェクターと上記Ｆｏｋ１を組み合わせたものであり、真核細胞由来以外の要素も含むものであるから、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系が原核細胞由来のものであるというだけで、当業者がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を真核細胞に適用することの試みさえ躊躇するものとはいい難い。また、ＺＦＮやＴＡＬＥＮのＤＮＡ結合ドメインが、真核細胞のクロマチン環境に特化した構造や標的配列認識機構を有しているとの事情も見いだせない。そうしてみると、ＺＦＮやＴＡＬＥＮと、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系との構造等の違いをもって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を真核細胞における標的ＤＮＡの切断に適用することが動機付けられないとはいえない。
以上のとおりであるから、原告の上記主張を採用することはできない。核局在化シグナルの付加の点について
原告は、前記第３の１⑴イのとおり、①ＺＦＮやＴＡＬＥＮよりもサ
イズが大きく構造も異なるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系が真核細胞の核膜を通過して核内へと移行することは想到できない、②核局在化シグナルを利用してポリペプチドを真核生物の核内に移行させられ得るとしても、核内に移行したＣａｓ９ポリペプチドがガイドＲＮＡと複合体を形成できるか予測できない、③引用発明の対象を真核細胞へと変更し、さらに、核内移行手段として核局在化シグナルを用いることは、いわゆる２ステップを要する「容易の容易」であるから、容易想到とはいえない旨主張する。
しかしながら、核局在化シグナルを有する物質が核膜に存在する小さ
な核膜孔を直径約１００ｎｍに開いて核内へと通過することは、本願第１優先日当時の技術常識であり（乙２９）、約１７０ｋＤａのＭＴａｓｅ（ＤＮＡシトシン―５―メチルトランスフェラーゼ）（乙３４）、約１８５ｋＤａのトポⅡ（ＤＮＡトポイソメラーゼⅡ）（乙３５）、約２３９ｋＤａのＳｅｎ１ｐ（乙３６）といった天然の核局在化シグナルを有するタンパク質が核膜孔を直径約１００ｎｍに開口して通過することが広く知られていたから、１６３ｋＤａ程度の分子量であるＣａｓ９ポリペプチドについて、核局在化シグナルを付加するという常套手段を採用することによって核内に移行させ得ることを十分に期待できたといえ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系がＺＦＮやＴＡＬＥＮよりもサイズが大きく構造も異なる点は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を真核細胞へ適用することの試みを何ら妨げない。そして、Ｃａｓ９ポリペプチドが核内に移行してガイドＲＮＡと複合体を形成できるか予測できないと主張する点は、前記第３の２⑴アｃの阻害要因３と同趣旨の主張であるから、前記の
とおり、単にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を真核細胞に適用する際に生じる事象の一般的・抽象的な可能性又は懸念を述べるにとどまるものである。そして、核局在化シグナルはタンパク質を真核細胞の核内に移行させ
るための常套手段であるから、引用発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を真核細胞に適用しようとすること、すなわち、Ｃａｓ９ポリペプチドを真核細胞の核内に移行しようとするならば、真核細胞の核内に移行する手段を採用するのは至極当然のことであり、Ｃａｓ９ポリペプチドへの核局在化シグナルの付加は、引用発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を真核細胞へ適用しようと試みると同時に当然導き出されることである。そうすると、核局在化シグナルの付加は、真核細胞に適用されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系との構成を前提にしてこれに対して更に改変を加えるというものではなく、いわゆる「容易の容易」に当たるようなものではない。
以上のとおりであるから、原告の上記主張を採用することはできない。そのほか原告がるる主張するところも、前記イの判断を左右するもの
ではない。
⑵予測できない顕著な効果について
原告は、前記第３の１⑵のとおり、本願発明には、真核細胞内のゲノムＤＮＡを切断し、編集することができるという予測できない顕著な効果がある旨主張する。
しかしながら、発明の効果が予測できない顕著なものであるかについては、当該発明の特許要件判断の基準日当時、当該発明の構成が奏するものとして当業者が予測することのできなかったものか否か、当該構成から当業者が予測することのできた範囲の効果を超える顕著なものであるか否かという観点から検討する必要がある（最高裁判所平成３０年（行ヒ）第６９号令和元年８月２７日第三小法廷判決・集民２６２号５１頁参照）。そして、本願発明の構成は、真核細胞における標的ＤＮＡを切断するための組成物であるから、そのような組成物が真核細胞内のゲノムＤＮＡを切断し、編集することができるのは当然に予想されるといい得るところ、原告が予測できない顕著な効果として主張するものは、いずれも、真核細胞における標的ＤＮＡを切断するための組成物であれば当然に備えることが予想される範囲内の効果をいうにすぎないから、本願発明に予測できない顕著な効果を認める余地はない。⑶まとめ
以上のとおりであるから、相違点１の構成は容易に想到することができ、そして、原告は、相違点２の構成が容易に想到できるとする本件審決の判断を争うものではなく、さらに、本願発明は予測できない顕著な効果を奏するものでもないから、本願発明は容易に発明することができたものである。
３ 結論
よって、取消事由は理由がないから、原告の請求を棄却することとして、主文のとおり判決する。
知的財産高等裁判所第４部
裁判長裁判官
菅野雅之
裁判官
本吉弘行
裁判官
中村恭
（別紙１）
本願明細書の記載事項（抜粋）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、真核細胞または真核生物における標的化ゲノム編集に関する。より詳細には、本発明は、標的ＤＮＡに特異的なガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質コード核酸もしくはＣａｓタンパク質を含有する、真核細胞または真核生物中の標的ＤＮＡを切断するための組成物、ならびにその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された規則的間隔の短いパリンドローム反復配列、ＣｌｕｓｔｅｒｅｄＲｅｇｕｌａｒｌｙＩｎｔｅｒｓｐａｃｅｄＳｈｏｒｔＰａｌｉｎｄｒｏｍｉｃＲｅｐｅａｔ）は、配列決定された細菌の約４０％および配列決定された古細菌の９０％のゲノムにおいて見出される多数の短い直列反復配列を含む遺伝子座である。ＣＲＩＳＰＲは、原核生物の免疫系として機能し、そこでそれは、プラスミドおよびファージなどの外因性の遺伝因子に対する抵抗性を与える。ＣＲＩＳＰＲシステムは、一種の獲得免疫をもたらす。スペーサーと呼ばれる外来ＤＮＡの短いセグメントは、ゲノムのＣＲＩＳＰＲリピートの間に組み込まれ、過去の曝露の記憶として機能する。ＣＲＩＳＰＲスペーサーは、その後、真核生物におけるＲＮＡｉと類似した方法で外因性遺伝因子を認識してサイレンシングするために用いられる。
【０００３】
タイプⅡＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに必須のタンパク質成分であるＣａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と呼ばれる２つのＲＮＡと複合体を形成した場合、活性を有するエンドヌクレアーゼを形成し、それによって侵入したファージまたはプラスミド中の外来遺伝因子を切断して、宿主細胞を防御する。ｃｒＲＮＡは、以前にこのような外来侵入物から捕捉された、宿主ゲノム内のＣＲＩＳＰＲエレメントから転写される。近年、Ｊｉｎｅｋら（１）は、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの必須部分の融合によって産生された一本鎖キメラＲＮＡがＣａｓ９／ＲＮＡ複合体中の２つのＲＮＡと置き換え可能であり、機能的なエンドヌクレアーゼを形成できることを実証した。
【０００４】
ヌクレオチド結合ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質における部位特異性は、設計および合成がより困難であり得るＤＮＡ結合タンパク質の代わりに、ＲＮＡ分子に支配されているので、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ジンクフィンガーおよび転写活性化因子様エフェクターＤＮＡ結合タンパク質に対して利点を提供する。しかし、今まで、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに基づくＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）を用いたゲノム編集法は、開発されていなかった。一方、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）は、分子生物学および遺伝学においていまだに広く使用されている、最も古く、最も簡便で、最も安価な遺伝子型決定法の１つであるが、制限エンドヌクレアーゼによって認識される適切な部位の欠如によってしばしば制限される。
【０００５】
人工（Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）ヌクレアーゼ誘発性突然変異は、様々な方法によって検出され、それらは、ミスマッチ感受性のＴ７エンドヌクレアーゼＩ（Ｔ７Ｅ１）アッセイまたはＳｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼアッセイ、ＲＦＬＰ、蛍光ＰＣＲ産物のキャピラリー電気泳動法、ジデオキシ配列決定法、およびディープシークエンシング（ｄｅｅｐｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を含む。Ｔ７Ｅ１およびＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイは広く用いられるが、煩雑である。更に、突然変異配列が互いとホモ二本鎖を形成する可能性があり、ホモ接合性の二対立遺伝子突然変異体クローンと野生型細胞とを区別できないため、これらの酵素は突然変異頻度を過小評価する傾向がある。ＲＦＬＰはこれらの制約がないため、好まれる方法である。実際、ＲＦＬＰは、細胞および動物において人工ヌクレアーゼ仲介性突然変異を検出するための最初の方法の１つであった。しかし残念なことに、ＲＦＬＰは適切な制限酵素認識部位の利用可能性によって制限される。目的とする標的部位で利用できる制限酵素認識部位がない可能性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
今まで、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに基づくＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）を用いたゲノム編集法および遺伝子型決定法は、開発されていなかった。
このような状況下において、本発明者らは、多くの努力を払って、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに基づくゲノム編集法を開発し、ついに真核細胞および真核生物において標的化してＤＮＡを切断するプログラム可能なＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを確立した。
加えて、本発明者らは、多くの努力を払って、ＲＦＬＰ分析におけるＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）の新規使用方法を開発した。本発明者らは、ＲＧＥＮを用いて、癌において見出される反復突然変異ならびにＲＧＥＮ自身を含む人工ヌクレアーゼによって細胞および生物に誘発された突然変異の遺伝子型決定を行い、それによって本発明を完成させた。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の目的は、標的ＤＮＡに特異的なガイドＲＮＡもしくはガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ、およびＣａｓタンパク質コード核酸もしくはＣａｓタンパク質を含有する、真核細胞または真核生物中の標的ＤＮＡを切断するための組成物を提供することである。
本発明の他の目的は、標的ＤＮＡに特異的なガイドＲＮＡもしくはガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ、およびＣａｓタンパク質コード核酸もしくはＣａｓタンパク質を含有する、真核細胞または真核生物において標的化突然変異生成を誘発するための組成物を提供することである。
【発明の効果】
【００２１】
真核細胞または真核生物において標的ＤＮＡを切断するための、または標的化突然変異生成を誘発するための、標的ＤＮＡに特異的なガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質コード核酸もしくはＣａｓタンパク質を含有する本組成物、本組成物を含むキット、ならびに標的化突然変異生成を誘発する方法は、新しい便利なゲノム編集ツールを提供する。加えて、カスタムＲＧＥＮは任意のＤＮＡ配列を標的とするように設計することができるため、ほぼすべての一塩基多型または小さな挿入／欠失（ｉｎｄｅｌ）は、ＲＧＥＮ仲介性ＲＦＬＰによって分析でき、従って、本発明の組成物および方法は、自然発生多型および突然変異の検出および切断に使用されうる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１ａ】図１は、ｉｎｖｉｔｒｏでのプラスミドＤＮＡのＣａｓ９触媒性切断を示す。（ａ）標的ＤＮＡおよびキメラＲＮＡ配列の模式図。赤い三角形は切断部位を示す。Ｃａｓ９によって認識されるＰＡＭ配列は太字で示される。ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡに由来するガイドＲＮＡ中の配列は、それぞれ、囲み内および下線で示される。
【図１ｂ】図１は、ｉｎｖｉｔｒｏでのプラスミドＤＮＡのＣａｓ９触媒性切断を示す。（ｂ）Ｃａｓ９によるプラスミドＤＮＡのｉｎｖｉｔｒｏでの切断。完全な（ｉｎｔａｃｔ）環状プラスミドまたはＡｐａＬＩ消化プラスミドを、Ｃａｓ９およびガイドＲＮＡとともにインキュベートした。
【図３ａ】図３は、内在性の染色体部位でのＲＧＥＮ誘発性突然変異を示す。（ａ）ＣＣＲ５遺伝子座。（上）Ｔ７Ｅ１アッセイを用いて、ＲＧＥＮ誘発性突然変異を検出した。矢印は、Ｔ７Ｅ１によって切断されるＤＮＡバンドの予測される位置を示す。突然変異頻度（Ｉｎｄｅｌｓ（％））は、バンド強度の測定によって計算された。（下）ＣＣＲ５およびＣ４ＢＰＢの野生型（ＷＴ）ならびに突然変異体クローンのＤＮＡ配列。ガイドＲＮＡに相補的な標的配列の領域は、囲み（ｂｏｃ）で示される。ＰＡＭ配列は太字で示される。三角形は切断部位を示す。マイクロホモロジーに相当する塩基には下線が引かれている。右側の列は、挿入または欠失した塩基数を示す。
【図１０ａ】図１０は、Ｃａｓ９タンパク質／ｓｇＲＮＡ複合体誘発性の標的化突然変異を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明の１つの態様に従って、本発明は、標的ＤＮＡに特異的なガイドＲＮＡもしくはガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ、およびＣａｓタンパク質コード核酸もしくはＣａｓタンパク質を含有する、真核細胞または真核生物中の標的ＤＮＡを切断するための組成物を提供する。加えて、本発明は、標的ＤＮＡに特異的なガイドＲＮＡもしくはガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ、およびＣａｓタンパク質コード核酸もしくはＣａｓタンパク質を含有する、真核細胞または真核生物中の標的ＤＮＡを切断するための組成物の使用を提供する。
本発明では、組成物はまた、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）組成物とも呼ばれる。
【００２４】
ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮは、哺乳類細胞、モデル生物、植物、および家畜類において標的化突然変異生成を可能にするが、個々のヌクレアーゼによって得られる突然変異頻度は、それぞれ大きく異なる。更に、いくつかのＺＦＮおよびＴＡＬＥＮは、ゲノム編集活性を示すことができない。ＤＮＡのメチル化は、これらの人工ヌクレアーゼの標的部位への結合を制限しうる。
加えて、カスタム化ヌクレアーゼを作製することは、技術的に困難であり、時間がかかる。
本発明者らは、Ｃａｓタンパク質に基づく新たなＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ組成物を開発することによって、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮの欠点を克服した。【００２５】
本発明より前に、Ｃａｓタンパク質のエンドヌクレアーゼ活性は知られていた。しかし、真核生物のゲノムの複雑さのため、Ｃａｓタンパク質のエンドヌクレアーゼ活性が真核細胞中で機能するかどうかは知られていなかった。更に、これまで、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質コード核酸および標的ＤＮＡに特異的なガイドＲＮＡを含有する、真核細胞または真核生物中の標的ＤＮＡを切断するための組成物は、開発されていなかった。
【００２６】
ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮと比較して、Ｃａｓタンパク質に基づく本ＲＧＥＮ組成物は、合成ガイドＲＮＡ成分が置き換えられるだけで新たなゲノム編集ヌクレアーゼを作製できるため、より容易にカスタム化され得る。サブクローニングステップは、カスタム化ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼの作製に含まれない。更に、一対のＴＡＬＥＮ遺伝子（～６ｋｂｐ）と比較して、比較的小さいサイズのＣａｓ遺伝子（例えば、Ｃａｓ９では４．２ｋｂｐ）は、ウイルス媒介性遺伝子送達などのいくつかの適用において、このＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ組成物に利点をもたらす。更に、このＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、オフターゲット作用を持たないため、望ましくない突然変異、欠失、逆位、および重複を引き起こさない。これらの特性は、本ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ組成物を、真核細胞および真核生物におけるゲノム工学のための拡張性のある、汎用的で便利なツールにする。加えて、ＲＧＥＮは、任意のＤＮＡ配列を標的とするように設計することができ、ほぼすべての一塩基多型または小さな挿入／欠失（ｉｎｄｅｌ）が、ＲＧＥＮ仲介性ＲＦＬＰによって分析され得る。ＲＧＥＮの特異性は、最大２０塩基対（ｂｐ）までの長さの標的ＤＮＡ配列とハイブリダイズするＲＮＡ成分およびプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識するＣａｓ９タンパク質によって決定される。ＲＧＥＮは、ＲＮＡ成分を置き換えることによって容易に再プログラム化される。従って、ＲＧＥＮは、様々な配列変異に対して簡単で確実なＲＦＬＰ分析を使用するための基盤をもたらす。
【００２７】
標的ＤＮＡは、内在性ＤＮＡ、または人工ＤＮＡ、好ましくは内在性ＤＮＡでありうる。
本明細書において用いられる場合、「Ｃａｓタンパク質」という用語は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいて必須のタンパク質成分を指し、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と呼ばれる２つのＲＮＡと複合体を形成した場合に、活性を有するエンドヌクレアーゼまたはニッカーゼを形成する。
Ｃａｓの遺伝子およびタンパク質に関する情報は、国立生物工学情報センター（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、ＮＣＢＩ）のＧｅｎＢａｎｋから、制限なく利用できる。
【００２８】
Ｃａｓタンパク質をコードするＣＲＩＳＰＲ関連（ｃａｓ）遺伝子はしばしば、ＣＲＩＳＰＲリピート－スペーサーアレイに関連付けられる。４０を超える異なるＣａｓタンパク質ファミリーが記載されている。これらのタンパク質ファミリーのうち、Ｃａｓ１は、様々なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに共通して遍在していると思われる。３種類のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムが存在する。それらのうち、Ｃａｓ９タンパク質ならびにｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含むタイプⅡＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、代表的であり、よく知られている。ｃａｓ遺伝子とリピート構造の特定の組合せを用いて、８つのＣＲＩＳＰＲサブタイプが定義されている（Ｅｃｏｌｉ、Ｙｐｅｓｔ、Ｎｍｅｎｉ、Ｄｖｕｌｇ、Ｔｎｅａｐ、Ｈｍａｒｉ、Ａｐｅｒｎ、およびＭｔｕｂｅ）。【００２９】
Ｃａｓタンパク質は、タンパク質形質導入ドメインに結合されうる。タンパク質形質導入ドメインは、ポリアルギニンまたはＨＩＶに由来するＴＡＴタンパク質でありうるが、それに限定されない。
本組成物は、タンパク質の形態で、またはＣａｓタンパク質をコードする核酸の形態で、Ｃａｓ成分を含有しうる。
本発明では、Ｃａｓタンパク質は、ガイドＲＮＡと複合体を形成した際、それがエンドヌクレアーゼ活性またはニッカーゼ活性を有する限り、任意のＣａｓタンパク質でありうる。
好ましくは、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質またはその変異型である。Ｃａｓ９タンパク質の変異型は、その中の触媒アスパラギン酸残基が他の任意のアミノ酸に変更されたＣａｓ９の突然変異型でありうる。好ましくは、他のアミノ酸はアラニンでありうるが、それに限定されない。
【００３０】
更に、Ｃａｓタンパク質は、ストレプトコッカス属菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．）、好ましくは化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｓ）などの生物から単離されたもの、または組換えタンパク質でありうるが、それらに限定されない。
化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｓ）に由来するＣａｓタンパク質は、ＮＧＧトリヌクレオチドを認識しうる。Ｃａｓタンパク質は、配列番号１０９のアミノ酸配列を含みうるが、それに限定されない。
【００３１】
「組換え」という用語は、例えば、細胞、核酸、タンパク質、またはベクターに関して用いられる場合、細胞、核酸、タンパク質またはベクターが、異種核酸もしくはタンパク質の導入によって、または天然の核酸もしくはタンパク質の変更によって改変されていること、あるいは細胞がそのように改変された細胞に由来することを示す。従って、例えば、組換えＣａｓタンパク質は、ヒトコドン表を用いてＣａｓタンパク質コード配列を再構成することによって生成されうる。
【００３２】
本発明において、Ｃａｓタンパク質コード核酸は、ＣＭＶまたはＣＡＧなどのプロモーターの制御下にＣａｓコード配列を含むプラスミドなどのベクターの形態でありうる。Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９である場合、Ｃａｓ９コード配列は、ストレプトコッカス属菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．）に由来し、好ましくは化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｓ）に由来しうる。例えば、Ｃａｓ９コード核酸は、配列番号１のヌクレオチド配列を含みうる。更に、Ｃａｓ９コード核酸は、配列番号１の配列に少なくとも５０％、好ましくは配列番号１に少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、９７、９８、または９９％の相同性を有するヌクレオチド配列を含みうるが、それに限定されない。Ｃａｓ９コード核酸は、配列番号１０８、１１０、１０６、または１０７のヌクレオチド配列を含みうる。
【００３３】
本明細書において用いられる場合、「ガイドＲＮＡ」という用語は、標的ＤＮＡに特異的であり、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成して、Ｃａｓタンパク質を標的ＤＮＡに持ってくることができるＲＮＡを指す。
本発明では、ガイドＲＮＡは、２つのＲＮＡ、すなわち、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）で構成され、またはｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの必須部分の融合によって作製される一本鎖ＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）でありうる。
ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含むデュアルＲＮＡでありうる。
ガイドＲＮＡがｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの必須部分ならびに標的と相補的な部分を含むならば、任意のガイドＲＮＡが本発明において使用されうる。【００３４】
ｃｒＲＮＡは、標的ＤＮＡにハイブリダイズしうる。
ＲＧＥＮは、Ｃａｓタンパク質およびデュアルＲＮＡ（不変のｔｒａｃｒＲＮＡおよび標的特異的ｃｒＲＮＡ）、またはＣａｓタンパク質およびｓｇＲＮＡ（不変のｔｒａｃｒＲＮＡおよび標的特異的ｃｒＲＮＡの必須部分の融合）で構成され、ｃｒＲＮＡの置き換えによって容易に再プログラム化されうる。
ガイドＲＮＡは、更に、一本鎖ガイドＲＮＡまたはデュアルＲＮＡのｃｒＲＮＡの５′末端に１つ以上の付加的なヌクレオチドを含む。
好ましくは、ガイドＲＮＡは、更に、一本鎖ガイドＲＮＡまたはデュアルＲＮＡのｃｒＲＮＡの５′末端に２つの付加的なグアニンヌクレオチドを含む。【００３５】
ガイドＲＮＡは、ＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードするＤＮＡの形態で、細胞または生物に移入されうる。ガイドＲＮＡは、単離されたＲＮＡ、ウイルスベクター内に組み込まれたＲＮＡの形であってもよく、またはベクターにコードされる。好ましくは、ベクターは、ウイルスベクター、プラスミドベクター、またはアグロバクテリウムベクターでありうるが、それらに限定されない。
ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、ガイドＲＮＡをコードする配列を含むベクターでありうる。例えば、ガイドＲＮＡは、単離されたガイドＲＮＡ、もしくはガイドＲＮＡおよびプロモーターをコードする配列を含むプラスミドＤＮＡを細胞または生物にトランスフェクトすることによって、細胞または生物に移入されうる。あるいは、ガイドＲＮＡは、ウイルス媒介性遺伝子送達を用いて、細胞または生物に移入されうる。
【００３６】
ガイドＲＮＡが単離ＲＮＡの形態で細胞または生物にトランスフェクトされる場合、ガイドＲＮＡは、当技術分野において既知の任意のｉｎｖｉｔｒｏ転写系を用いたｉｎｖｉｔｒｏでの転写によって調製されうる。ガイドＲＮＡは、好ましくは、ガイドＲＮＡのコード配列を含むプラスミドの形態よりもむしろ、単離ＲＮＡの形態で細胞に移入される。本明細書において用いられる場合、「単離ＲＮＡ」という用語は、「裸のＲＮＡ」と置き換え可能でありうる。これは、クローニングのステップを必要としないため、コストと時間の節約になる。しかし、ガイドＲＮＡのトランスフェクションのためのプラスミドＤＮＡの使用またはウイルス媒介性遺伝子送達は、排除されない。
【００３７】
Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質コード核酸およびガイドＲＮＡを含有する本ＲＧＥＮ組成物は、標的に対するガイドＲＮＡの特異性およびＣａｓタンパク質のエンドヌクレアーゼ活性またはニッカーゼ活性のため、標的ＤＮＡを特異的に切断し得る。
本明細書において用いられる場合、「切断」という用語は、ヌクレオチド分子の共有結合骨格の切断を指す。
本発明では、ガイドＲＮＡは、切断されるべき任意の標的に特異的であるように調製されうる。従って、本ＲＧＥＮ組成物は、ガイドＲＮＡの標的特異的部分を操作または遺伝子型決定することによって、任意の標的ＤＮＡを切断し得る。【００３９】
本発明では、組成物は、ｉｎｖｉｔｒｏでの真核細胞または真核生物のゲノムの遺伝子型決定に使用されうる。
１つの特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号１のヌクレオチド配列を含みうるが、そのヌクレオチド位置３～２２の部分は標的特異的部分であり、従ってこの部分の配列は標的に応じて変化しうる。
本明細書において用いられる場合、真核細胞または真核生物は、当技術分野において一般的に用いられる、酵母、真菌類、原生生物、植物、高等植物、ならびに昆虫、または両生類細胞、またはＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、およびＣＯＳ－１などの哺乳類細胞、例えば、培養細胞（ｉｎｖｉｔｒｏ）、移植細胞および初代培養細胞（ｉｎｖｉｔｒｏおよびｅｘｖｉｖｏ）、およびｉｎｖｉｖｏ細胞、ならびにヒトなどの哺乳類細胞でもありうるが、それらに限定されない。【００４０】
１つの特定の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質／一本鎖ガイドＲＮＡは、ｉｎｖｉｔｒｏおよび哺乳類細胞内で部位特異的ＤＮＡ二本鎖切断を生じることができ、その自発的修復が、高頻度で標的化ゲノム突然変異を誘発することが見出された。更に、Ｃａｓ９タンパク質／ガイドＲＮＡ複合体またはＣａｓ９ｍＲＮＡ／ガイドＲＮＡの１細胞期胚への注入によって、遺伝子ノックアウトマウスが誘導され得ること、および生殖細胞系列に伝達可能な突然変異がＣａｓ９／ガイドＲＮＡシステムによって生じ得ることが見出された。
Ｃａｓタンパク質をコードする核酸よりもむしろＣａｓタンパク質を用いて、標的化突然変異生成を誘発することは、外来性ＤＮＡが生物内に導入されないため、有利である。従って、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡを含有する組成物は、治療薬または付加価値のある農作物、家畜、家禽、魚、ペットなどの開発に使用されうる。
【実施例１】
【００５８】
ゲノム編集アッセイ
１－１．Ｃａｓ９タンパク質のＤＮＡ切断活性
初めに、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｓ）に由来するＣａｓ９のＤＮＡ切断活性をｉｎｖｉｔｒｏでのキメラガイドＲＮＡの存在下または非存在下で試験した。
この目的のために、Ｅ．ｃｏｌｉで発現され、精製された組換えＣａｓ９タンパク質を用いて、２３塩基対（ｂｐ）のヒトＣＣＲ５標的配列を含む前消化されたプラスミドＤＮＡまたは環状プラスミドＤＮＡを切断した。Ｃａｓ９標的配列は、ｃｒＲＮＡまたはキメラガイドＲＮＡと相補的な２０－ｂｐのＤＮＡ配列およびＣａｓ９自身によって認識されるトリヌクレオチド（５′－ＮＧＧ－３′）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）で構成される（図１ａ）。
【００５９】
具体的には、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｓ）株Ｍ１ＧＡＳ（ＮＣ＿００２７３７．１）に由来するＣａｓ９コード配列（４，１０４ｂｐ）を、ヒトコドン使用表を用いて再構成し、オリゴヌクレオチドを用いて合成した。初めに、重複する～３５－ｍｅｒオリゴヌクレオチドおよびＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）を用いて１－ｋｂＤＮＡセグメントを組み立て、Ｔ－ベクター（ＳｏｌＧｅｎｔ）にクローニングした。４つの１－ｋｂｐＤＮＡセグメントを用いて、オーバーラップＰＣＲによって、完全長Ｃａｓ９配列を組み立てた。Ｃａｓ９コードＤＮＡセグメントを、（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に由来するｐ３ｓにサブクローニングした。このベクターにおいて、ＨＡエピトープおよび核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含むペプチドタグ（ＮＨ２－ＧＧＳＧＰＰＫＫＫＲＫＶＹＰＹＤＶＰＤＹＡ－ＣＯＯＨ、配列番号２）を、Ｃａｓ９のＣ末端に付加した。Ｃａｓ９タンパク質のＨＥＫ２９３Ｔ細胞における発現および核局在化を、抗ＨＡ抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ）を用いたウェスタンブロッティングによって確認した。
【００６０】
その後、Ｃａｓ９カセットをｐＥＴ２８－ｂ（＋）にサブクローニングして、ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。０．５ｍＭＩＰＴＧを用いて２５℃で４時間、Ｃａｓ９の発現を誘導した。Ｃ末端にＨｉｓ６－タグを有するＣａｓ９タンパク質を、Ｎｉ－ＮＴＡアガロース樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、２０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭＫＣｌ、１ｍＭＤＴＴ、および１０％グリセロールに対して透析した（１）。精製したＣａｓ９（５０ｎＭ）を、スーパーコイルプラスミドＤＮＡまたは前消化プラスミドＤＮＡ（３００ｎｇ）およびキメラＲＮＡ（５０ｎＭ）とともに、２０μｌの反応容量のＮＥＢバッファー３中で、３７℃で１時間インキュベートした。消化されたＤＮＡを、０.８％アガロースゲルを用いた電気泳動によって分析した。
Ｃａｓ９は、合成ＲＮＡの存在下でのみ、予想された位置で効率的にプラスミドＤＮＡを切断し、標的配列のない対照プラスミドを切断しなかった（図１ｂ）。【００６１】
１－２．ヒト細胞でのＣａｓ９／ガイドＲＮＡ複合体によるＤＮＡ切断ＲＦＰ－ＧＦＰレポーターを用いて、Ｃａｓ９／ガイドＲＮＡ複合体が哺乳類細胞においてＲＦＰとＧＦＰ配列の間に組み込まれた標的配列を切断できるかどうかを調べた。
このレポーターでは、ＧＦＰ配列は、フレームシフトしてＲＦＰ配列と融合している（２）。活性を有するＧＦＰは、標的配列が部位特異的ヌクレアーゼによって切断され、エラーを起こしやすい二本鎖切断（ＤＳＢ）の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）修復によって、標的配列付近にフレームシフトを起こす小さな挿入または欠失（ｉｎｄｅｌ）を生じた場合のみに発現する（図２）。
【００６２】
この研究に使用されるＲＦＰ－ＧＦＰレポータープラスミドは、以前に記載されたように構築された（２）。標的部位に対応するオリゴヌクレオチド（表１）を合成し（Ｍａｃｒｏｇｅｎ）、アニールした。アニールしたオリゴヌクレオチドを、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化したレポーターベクターにライゲーションした。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、２４ウェルプレート中で、Ｃａｓ９コードプラスミド（０.８μｇ）およびＲＦＰ－ＧＦＰレポータープラスミド（０.２μｇ）を同時トランスフェクトした。
【００６３】
一方、ｉｎｖｉｔｒｏ転写されたキメラＲＮＡは、下記のように調製した。ＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔＴ７キット（Ａｍｂｉｏｎ）を用い、メーカーの説明書に従ったラン・オフ反応によって、ＲＮＡをｉｎｖｉｔｒｏ転写した。ＲＮＡのｉｎｖｉｔｒｏ転写のための鋳型は、２つの相補的な一本鎖ＤＮＡのアニーリングによって、またはＰＣＲ増幅によって生成された（表１）。転写されたＲＮＡを８％変性尿素－ＰＡＧＥゲル上で分離した。ＲＮＡを含むゲル切片を切り出し、プローブ溶出バッファーに移した。ＲＮＡをヌクレアーゼを含まない水に回収し、続いてフェノール・クロロホルム抽出、クロロホルム抽出、およびエタノール沈澱を行った。精製したＲＮＡを分光分析によって定量した。
【００６４】
トランスフェクションの１２時間後、ｉｎｖｉｔｒｏ転写によって調製されたキメラＲＮＡ（１μｇ）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの３日後、トランスフェクトされた細胞をフローサイトメトリーに供し、ＲＦＰとＧＦＰとの両方を発現している細胞を計測した。ＧＦＰ発現細胞は、細胞が最初にＣａｓ９プラスミドによってトランスフェクトされ、その１２時間後にガイドＲＮＡによってトランスフェクトされた場合にのみ得られることが見出され（図２）、ＲＧＥＮが培養ヒト細胞中の標的ＤＮＡ配列を認識して切断できることが実証された。このように、ＧＦＰ発現細胞は、同時トランスフェクションよりもむしろＣａｓ９プラスミドおよびガイドＲＮＡの連続トランスフェクションによって得られた。
・・・
【００６５】
１－３．哺乳類細胞の内在性遺伝子のＲＧＥＮによる標的破壊
ＲＧＥＮが哺乳類細胞の内在性遺伝子の標的破壊に使用され得るかどうかを試験するために、野生型と突然変異体ＤＮＡ配列のハイブリダイゼーションによって形成されるヘテロ二本鎖を特異的に認識して切断するミスマッチ感受性エンドヌクレアーゼであるＴ７エンドヌクレアーゼＩ（Ｔ７Ｅ１）を用いて、トランスフェクトされた細胞から単離したゲノムＤＮＡを分析した（３）。
ＲＧＥＮを用いて哺乳類細胞にＤＳＢを導入するために、４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ、ＳＦＣｅｌｌＬｉｎｅ４Ｄ－ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒＸＫｉｔ、ＰｒｏｇｒａｍＦＦ－１２０（Ｌｏｎｚａ）を用い、メーカーのプロトコールに従って、２×１０６Ｋ５６２細胞に２０μｇのＣａｓ９コードプラスミドをトランスフェクトした。この実験のために、Ｋ５６２（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ－２４３）細胞を、１０％ＦＢＳならびにペニシリン／ストレプトマイシン混合物（それぞれ、１００Ｕ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌ）を含むＲＰＭＩ－１６４０中で増殖させた。
【００６６】
２４時間後、１０～４０μｇのｉｎｖｉｔｒｏ転写されたキメラＲＮＡを、１×１０６Ｋ５６２細胞にヌクレオフェクト（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｅｄ）した。ｉｎｖｉｔｒｏ転写されたキメラＲＮＡは、実施例１－２に記載されたように調製された。ＲＮＡトランスフェクションの２日後に細胞を回収し、ゲノムＤＮＡを単離した。標的部位を含む領域を、表１に記載されるプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。アンプリコンを、以前に記載されたようなＴ７Ｅ１アッセイに供した（３）。配列解析のために、ゲノム改変に相当するＰＣＲ産物を精製し、Ｔ－ＢｌｕｎｔＰＣＲＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ（ＳｏｌＧｅｎｔ）を用いてＴ－Ｂｌｕｎｔベクターにクローニングした。Ｍ１３プライマーを用いて、クローニングされた産物を配列決定した。
【００６７】
突然変異は、細胞がＣａｓ９コードプラスミド、その後ガイドＲＮＡによって連続的にトランスフェクトされた場合にのみ誘発されることが見出された（図３）。相対的なＤＮＡバンド強度から推定される突然変異頻度（図３ａのＩｎｄｅｌｓ（％））は、ＲＮＡ用量依存的であり、１.３％～５.１％であった。ＰＣＲアンプリコンのＤＮＡ配列解析は、内在性部位でのＲＧＥＮ仲介性突然変異の誘発を裏付けた。エラーを起こしやすいＮＨＥＪの特徴であるＩｎｄｅｌおよびマイクロホモロジーが、標的部位で観察された。直接配列決定によって測定された突然変異頻度は、７．３％（＝７突然変異体クローン／９６クローン）であり、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）によって得られるものと同程度であった。
細胞に突然変異を誘発するためには、Ｃａｓ９プラスミドおよびガイドＲＮＡの連続トランスフェクションが必要であった。しかし、ガイドＲＮＡをコードするプラスミドの場合、連続トランスフェクションは不要であり、細胞はＣａｓ９プラスミドおよびガイドＲＮＡコードプラスミドによって同時トランスフェクトされた。【００６８】
その一方で、ＺＦＮとＴＡＬＥＮとの両方は、ＨＩＶ感染の必須の共受容体であるＧタンパク質共役ケモカイン受容体をコードする、ヒトＣＣＲ５遺伝子を破壊するための開発に成功している（３～６）。ＣＣＲ５特異的ＺＦＮは、現在米国でＡＩＤＳ治療のための臨床試験中である（７）。しかし、これらのＺＦＮおよびＴＡＬＥＮは、オフターゲット作用を有し、それは、その配列がオンターゲット配列と相同である部位での局所的突然変異（６、８～１０）、ならびにオンターゲット部位およびオフターゲット部位に引き起こされた２つの同時に起こるＤＳＢの修復から生じるゲノム再配列（１１～１２）の両方を含む。これらのＣＣＲ５特異的人工ヌクレアーゼと関連する最も顕著なオフターゲット部位は、ＣＣＲ５の近縁ホモログであり、ＣＣＲ５の１５－ｋｂｐ上流に位置する、ＣＣＲ２遺伝子座に存在する。ＣＣＲ２遺伝子におけるオフターゲット突然変異、ならびにＣＣＲ５オンターゲット部位とＣＣＲ２オフターゲット部位との間の１５－ｋｂｐ染色体セグメントの望ましくない欠失、逆位、および重複を避けるため、本発明者らは、ＣＣＲ２配列と明白な相同性を持たないＣＣＲ５配列内の領域を認識するように、我々のＣＣＲ５特異的ＲＧＥＮの標的部位を意図的に選択した。
【実施例２】
【００７１】
タンパク質性のＲＧＥＮによって仲介されるゲノム編集
ＲＧＥＮは、多くの異なる形態で細胞内に送達され得る。ＲＧＥＮは、Ｃａｓ９タンパク質、ｃｒＲＮＡ、およびｔｒａｃｒＲＮＡで構成される。２つのＲＮＡは、一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を形成するように融合され得る。ＣＭＶまたはＣＡＧなどのプロモーターの制御下でＣａｓ９をコードするプラスミドは、細胞内にトランスフェクトされ得る。ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、またはｓｇＲＮＡはまた、これらのＲＮＡをコードするプラスミドを用いて細胞内で発現され得る。しかし、プラスミドの使用は、しばしば、プラスミド全体または一部の宿主ゲノムへの組込みを引き起こす。プラスミドＤＮＡに組み込まれた細菌の配列は、ｉｎｖｉｖｏでの望ましくない免疫反応を引き起こし得る。細胞療法のためにプラスミドをトランスフェクトされた細胞またはＤＮＡトランスフェクト細胞に由来する動物および植物は、ほとんどの先進国において販売承認の前に、コストがかかり長期にわたる規制手続を通過しなくてはならない。更に、プラスミドＤＮＡは、トランスフェクション後数日間細胞内に残存し、ＲＧＥＮのオフターゲット作用を悪化させ得る。
【００７２】
ここで、我々は、ｉｎｖｉｔｒｏ転写されたガイドＲＮＡと複合体を形成した組換えＣａｓ９タンパク質を用いて、ヒト細胞の内在性遺伝子の標的破壊を誘発した。ヘキサヒスチジンタグと融合された組換えＣａｓ９タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ内で発現させ、標準的なＮｉイオンアフィニティークロマトグラフィーおよびゲルろ過を用いて精製した。精製された組換えＣａｓ９タンパク質を、保存バッファー（２０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．５、１５０ｍＭＫＣｌ、１ｍＭＤＴ
Ｔ、および１０％グリセロール）中で濃縮した。Ｃａｓ９タンパク質／ｓｇＲＮＡ複合体を、ヌクレオフェクション（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ）によってＫ５６２細胞に直接導入した。すなわち、４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ、ＳＦＣｅｌｌＬｉｎｅ４Ｄ－ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒＸＫｉｔ、Ｐｒｏｇｒａ
ｍ ＦＦ－１２０（Ｌｏｎｚａ）を用い、メーカーのプロトコールに従って、１００μｌの溶液中の、１００μｇ（２９μＭ）のｉｎｖｉｔｒｏ転写されたｓｇＲＮＡ（またはｃｒＲＮＡ４０μｇおよびｔｒａｃｒＲＮＡ８０μｇ）と混合された２２．５～２２５（１．４～１４μＭ）のＣａｓ９タンパク質を１×１０６Ｋ５６２細胞にトランスフェクトした。ヌクレオフェクション後、細胞を６ウェルプレート中の増殖培地に入れ、４８時間インキュベートした。２×１０５Ｋ５６２細胞を１／５にスケールダウンした方法でトランスフェクトした場合は、６～６０μｇのｉｎｖｉｔｒｏ転写されたｓｇＲＮＡ（またはｃｒＲＮＡ８μｇおよびｔｒａｃｒＲＮＡ１６μｇ）と混合された４．５～４５μｇのＣａｓ９タンパク質を用いて、２０μｌの溶液中でヌクレオフェクトした。ヌクレオフェクトされた細胞を、その後、４８ウェルプレート中の増殖培地に入れた。４８時間後、細胞を回収し、ゲノムＤＮＡを単離した。標的部位にわたるゲノムＤＮＡ領域をＰＣＲ増幅し、Ｔ７Ｅ１アッセイに供した。
【００７３】
図１０に示すように、Ｃａｓ９タンパク質／ｓｇＲＮＡ複合体は、ｓｇＲＮＡまたはＣａｓ９タンパク質の用量依存的に４．８～３８％の頻度でＣＣＲ５遺伝子座に標的化突然変異を誘発し、これはＣａｓ９プラスミドのトランスフェクションによって得られる頻度（４５％）と同程度であった。タンパク質／ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体は、９．４％の頻度で突然変異を誘発することができた。Ｃａｓ９タンパク質単独では、突然変異を誘発できなかった。２×１０５細胞を１／５にスケールダウンした用量のＣａｓ９タンパク質およびｓｇＲＮＡでトランスフェクトした場合、ＣＣＲ５遺伝子座での突然変異頻度は、用量依存的に２．７～５７％に及び、Ｃａｓ９プラスミドおよびｓｇＲＮＡプラスミドの同時トランスフェクションによって得られた頻度（３２％）より高かった。
【００７４】
我々はまた、ＡＢＣＣ１１遺伝子を標的とするＣａｓ９タンパク質／ｓｇＲＮＡ複合体をも試験し、この複合体が３５％の頻度でｉｎｄｅｌを誘発することを見出し、この方法の汎用性を実証した。
【実施例３】
【００７５】
マウスにおけるＲＮＡ誘導型ゲノム編集
・・・
【実施例４】
【００８７】
植物におけるＲＮＡ誘導型ゲノム編集
・・・
【実施例５】
【００９２】
細胞透過性ペプチドまたはタンパク質形質導入ドメインを用いたＣａｓ９タンパク質形質導入
・・・
【実施例６】
【０１００】
ガイドＲＮＡ構造によるオフターゲット突然変異の制御
【実施例７】
【０１０２】
ペアードＣａｓ９ニッカーゼ
・・・
【実施例８】
【０１０５】
ペアードＣａｓ９ニッカーゼによって誘発される染色体ＤＮＡスプライシング・・・
【実施例９】
【０１０９】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓに由来するＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを用いた遺伝子型決定
・・・
【０１２９】
参考文献
１．Ｍ．Ｊｉｎｅｋｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ３３７，８１６（Ａｕｇ１７，２０１２）．【図１ａ】
【図１ｂ】
【図３ａ】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【図４ｃ】
【図１０ａ】
（別紙２）
引用文献１の記載事項（抜粋・訳文）
［８１６頁表題］
細菌の獲得免疫におけるプログラム可能な二重ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ
［８１６頁要約］
クラスター化され、規則的に間隔が空いている短い回文の反復（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）系は、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を用いて、侵入する核酸のサイレンシングを誘導することで、ウイルスやプラスミドに対する獲得免疫を細菌や古細菌に提供する。ここで私たちは、これらの系の一部において、成熟ｃｒＲＮＡが、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と塩基対になって２つのＲＮＡからなる構造を形成し、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質Ｃａｓ９に標的ＤＮＡの二本鎖切断を指示することを示す。・・・このデュアル－ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡは、一本鎖ＲＮＡキメラとして設計されたときも、配列特異的に、Ｃａｓ９による二本鎖ＤＮＡ切断を誘導する。私たちの研究は、部位特異的ＤＮＡ切断のためにデュアル－ＲＮＡを使用するエンドヌクレアーゼのファミリーを明らかにし、ＲＮＡでプログラム可能なゲノム編集のためにこのシステムを利用する可能性を強調する。
［８１６頁中欄２５ないし３５行目］
ここで私たちは、Ⅱ型の系において、Ｃａｓ９タンパク質が、標的二本鎖ＤＮＡを切断するために、活性化ｔｒａｃｒＲＮＡと標的指向ｃｒＲＮＡの間の塩基対構造を必要とする酵素ファミリーを構成するものであることを示す。位置特異的切断は、標的であるプロトスペーサーＤＮＡとｃｒＲＮＡの間の塩基対を形成する相補性と、標的ＤＮＡの領域に並置される短いモチーフ［プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる］により定められる場所で生じる。
［８１６頁中欄３５行目ないし右欄３行目］
私たちの研究は、さらに、特定のＤＮＡ部位を切断するＣａｓ９エンドヌクレアーゼ・ファミリーが、単一のＲＮＡ分子によってプログラムされ得るため、それを応用してゲノム標的化及びゲノム編集のための二本鎖ＤＮＡ切断を引き起こす、単純かつ汎用的なＲＮＡ誘導型システムを開発することができるという刺激的な可能性を示している。
［８１６頁右欄１９ないし２５行目］
私たちは、成熟ｃｒＲＮＡ単独では、Ｃａｓ９に触媒されるプラスミドＤＮＡの切断を導けないことを発見した。・・・しかしながら、ｃｒＲＮＡの反復配列と対を形成し、この系においてｃｒＲＮＡの成熟に必要不可欠であるｔｒａｃｒＲＮＡを追加することが、Ｃａｓ９がプラスミドＤＮＡを切断することの引き金となった。［８１６頁右欄２６ないし２８行目］
この切断反応には、マグネシウムおよびＤＮＡに相補的なｃｒＤＮＡの存在の両方が必要であった。
［８２０頁左欄２ないし５行目］
・・・単一のＲＮＡ誘導型Ｃａｓ９の実現性は、プログラムされたＤＮＡ切断およびゲノム編集において潜在的に有用であるため、魅力的である・・・。［８２０頁左欄５ないし１８行目］
私たちは、標的認識配列を５′末端に含み、その下流にｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡの間に生じる塩基対相互作用を保持するヘアピン構造を含む２つのバージョンのキメラＲＮＡを設計した（図５Ｂ）。・・・プラスミドＤＮＡを用いた切断アッセイにおいて、長い方のキメラＲＮＡは、切断されたｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ複合体を用いた場合に観察された場合と同じような挙動で、Ｃａｓ９によるＤＮＡ切断を誘導できることを観察によって確認した（図５Ｂ並びに図Ｓ１４Ａ及びＣ）。［８２０頁図５］
図５Ｃａｓ９は、ｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡの特徴を組み合わせた単一のエンジニアリングされたＲＮＡ分子を使用して、プログラムすることができる。（Ａ）（上）Ⅱ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいて、Ｃａｓ９は、活性化しているｔｒａｃｒＲＮＡ及び標的化ｃｒＲＮＡにより形成される２つのＲＮＡ構造により誘導されて、部位特異的に標的となった二本鎖ＤＮＡを切断する（図Ｓ１参照）。（下）ｃｒＲＮＡの３′末端をｔｒａｃｒＲＮＡの５′末端に融合することにより生成されたキメラＲＮＡ。
［８２０頁左欄２９行目ないし中欄１４行目］
最後に、キメラＲＮＡの設計が普遍的に適用可能であるかどうかを確認するために、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ：ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ）をコードする遺伝子の一部を標的とする５種類の異なるキメラ誘導ＲＮＡを設計し（図Ｓ１５、ＡとＣ）、ＧＦＰコード配列を有するプラスミドに対するそれらの有効性をインビトロで試験した。全５例において、これらのキメラＲＮＡでプログラムされたＣａｓ９は、正確な標的部位でプラスミドを効率的に切断し（図５ＤおよびＳ１５Ｄ）、キメラＲＮＡの合理的な設計が堅牢であること、および原理的には、標的配列に隣接するＧＧジヌクレオチドの存在を越えてほとんど制限なく任意のＤＮＡ配列の標的化を可能とし得ることを示した。
［８２０頁右欄２ないし９行目］
ジンク－フィンガーヌクレアーゼや転写活性化様エフェクターヌクレアーゼは、ゲノムを操作するために設計された人工酵素として、大きな関心を集めた。私たちは、遺伝子ターゲティングとゲノム編集への応用に向けた大きな潜在能力をもたらし得るＲＮＡによりプログラムされたＣａｓ９に基づく代替的な手法を提案する。［「ＳＵＰＰＬＥＭＥＮＴＡＲＹＭＡＴＥＲＩＡＬＳＡＮＤＭＥＴＨＯＤＳ」の「ＰｌａｓｍｉｄＤＮＡｃｌｅａｖａｇｅａｓｓａｙ」］
プラスミドＤＮＡ切断アッセイ
・・・未処理の、あるいは制限酵素処理により鎖状化されたプラスミドＤＮＡ（３００ｎｇ（～８ｎＭ））は、精製されたＣａｓ９タンパク質（５０～５００ｎＭ）とｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ複合体（５０～５００ｎＭ、１：１）とともに、Ｃａｓ９プラスミド切断緩衝液（２０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７.５、１５０ｍＭＫＣＬ、０.５ｍＭＤＴＴ、０.１ｍＭＥＤＴＡ）中で、１０ｍＭＭｇＣｌ２を加えて、あるいは加えずに、３７℃で６０分間インキュベートした。
［「ＳＵＰＰＬＥＭＥＮＴＡＲＹＭＡＴＥＲＩＡＬＳＡＮＤＭＥＴＨＯＤＳ」の「Ｍｅｔａｌ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｃｌｅａｖａｇｅａｓｓａｙ」］
金属依存性切断アッセイ
・・・。
［「ＳＵＰＰＬＥＭＥＮＴＡＲＹＦＩＧＵＲＥＳ」］
図Ｓ４.Ｃａｓ９は３′―５′エクソヌクレアーゼ活性を有する、Ｍｇ２＋依存性のエンドヌクレアーゼである。
［８２０頁図５Ａ］
出典：裁判所ウェブサイト「裁判例検索」（https://www.courts.go.jp/hanrei/91645/detail7/index.html）。本文は同サイト掲載の判決書PDFからTaiLexi AIがテキスト化・整形したもの（正確な文言は原本PDFを参照）。判示事項・裁判要旨・参照法条は裁判所の公表どおり。