審判番号 不服2023-007017
請求人 マックス－プランク－ゲゼルシャフト・ツア・フェルデルング・デア・ヴィッセンシャフテン・エー・ファオ（代理人 弁理士3名）
特願２０２１－２１１５３「プラグフローチューブ型バイオリアクター、それを含むシステム、およびウイルスの調製のための方法」拒絶査定不服審判事件〔令和３年５月２０日出願公開、特開２０２１－７４０１８〕について、次のとおり審決する。
結 論
本件審判の請求は、成り立たない。
理 由
第１ 手続の経緯
本願は、２０１６年（平成２８年）５月６日を国際出願日とする外国語特許出願（特願２０１８－５５７３９３号）の一部を、令和３年２月１２日に新たな外国語書面出願としたものであって、その手続の経緯の概略は、次のとおりである。
令和３年２月１２日 ：翻訳文の提出
令和３年３月１５日 ：手続補正書の提出
令和４年２月２８日付け：拒絶理由通知書
同年９月５日 ：意見書、手続補正書の提出
同年１２月２３日付け：拒絶査定(以下「原査定」という。)
（同月２７日 ：原査定の謄本の送達）
令和５年４月２７日 ：審判請求書、手続補正書の提出
第２ 令和５年４月２７日にされた手続補正についての補正の却下の決定
［補正の却下の決定の結論］
令和５年４月２７日にされた手続補正を却下する。
［補正の却下の決定の理由］
１ 本件補正の内容
令和５年４月２７日にされた手続補正（以下「本件補正」という。）は、特許請求の範囲について補正をするものであり、本件補正により、次の(１)に示す本件補正前（令和４年９月５日にされた手続補正後のものをいう。以下同じ。）の特許請求の範囲の請求項１の記載は、後記(２)に示す本件補正後の特許請求の範囲の請求項１の記載に補正された。下線は補正箇所を示す。
(１) 本件補正前
「【請求項１】
真核細胞の培養、および感染、ウイルストランスダクションまたはトランスフェクションに適合した、少なくとも１つの入口および少なくとも１つの出口を備え、入口がチューブの第１端に存在し、出口がチューブの第２端に存在し、チューブの長さ－対－直径の比が少なくとも５０００：１であるチューブを有し、チューブがコイル状チューブである、プラグフローチューブ型バイオリアクター。」
(２) 本件補正後
「【請求項１】
真核細胞の培養、および感染、ウイルストランスダクションまたはトランスフェクションに適合した、少なくとも１つの入口および少なくとも１つの出口を備え、入口がチューブの第１端に存在し、出口がチューブの第２端に存在し、チューブの長さ－対－直径の比が少なくとも５０００：１であるチューブを有し、チューブがコイル状チューブであり、
前記細胞およびウイルスが、細胞のウイルス感染、ウイルストランスダクションまたはトランスフェクションを維持するのに十分な時間チューブ内で保持されている、
プラグフローチューブ型バイオリアクター。」
２ 本件補正の目的
本件補正のうち請求項１についてする補正は、実質的に本件補正前の請求項１に記載された「チューブ」について、「前記細胞およびウイルスが、細胞のウイルス感染、ウイルストランスダクションまたはトランスフェクションを維持するのに十分な時間チューブ内で保持されている」ものに限定するものである。
そして、本件補正前の請求項１に記載された発明と本件補正後の請求項１に記載される発明は、産業上の利用分野及び解決しようとする課題が同一である。
したがって、本件補正により請求項１についてする補正は、特許法１７条の２第５項２号に掲げる特許請求の範囲の減縮を目的とする補正に該当する。
３ 独立特許要件の判断
本件補正は、前記２のとおり、特許法１７条の２第５項２号に掲げる特許請求の範囲の減縮を目的とする補正に該当するから、本件補正後の請求項１に記載されている事項により特定される発明（以下「本件補正発明」という。）が、同法１７条の２第６項において準用する同法１２６条７項の規定に適合するか、すなわち、特許出願の際独立して特許を受けることができるものであるかについて、以下検討する。
(１) 本件補正発明の認定等
ア 本件補正発明の認定と分説
本件補正発明は、前記１(２)に摘記した本件補正後の請求項１に記載された事項により特定されるとおりのものと認める。
ここで、検討の便宜上、本件補正発明の構成を次のとおり構成Ｘと構成Ａから構成Ｅまでに分説する。また、参考図として、本願の【図２】に部材名等を記入したものを掲載する。
＜本件補正発明の分説＞
【請求項１】
Ａ 真核細胞の培養、および感染、ウイルストランスダクションまたはトランスフェクションに適合した、
Ｂ 少なくとも１つの入口および少なくとも１つの出口を備え、入口がチューブの第１端に存在し、出口がチューブの第２端に存在し、
Ｃ チューブの長さ－対－直径の比が少なくとも５０００：１であるチューブを有し、
Ｄ チューブがコイル状チューブであり、
Ｅ 前記細胞およびウイルスが、細胞のウイルス感染、ウイルストランスダクションまたはトランスフェクションを維持するのに十分な時間チューブ内で保持されている、
Ｘ プラグフローチューブ型バイオリアクター。
＜参考図＞
【図２】
〔図省略〕
イ 課題・効果等に関連する明細書の発明の詳細な説明の記載
本願明細書の発明の詳細な説明の記載のうち、発明が解決しようとする課題及び作用効果等に関連する記載を抜粋すると、次の記載がある。なお、下線は当合議体による。
「【背景技術】
【０００２】
細胞培養由来のインフルエンザワクチン製造のための現在の工業的方法は、大部分が、バッチ式で操作される撹拌槽型バイオリアクター(stirred tank bioreactor)（ＳＴＲ）を用いて実施される。（中略）
【０００５】
もうひとつの方法は、２（またはより多い）カスケードの撹拌槽型バイオリアクター（ＳＴＲ）を用いる連続法である。このシステムでは、細胞増殖とウイルス増殖が別の容器内で行なわれる。すなわち、連続方式で操作される２－ＳＴＲカスケードシステムの第１容器においては、トランスフェクションすべき細胞を連続的に増殖させ、その細胞の一部を連続的に第２容器へ移し、そこでウイルス感染、ならびに感染した細胞およびウイルスの増殖が行なわれる。ウイルス増殖バイオリアクターは連続的に収穫される。しかし、このタイプの“連続的”バイオリアクター製造法は、経時的な目的外の抗原変動のリスク、およびウイルス集団における欠陥干渉粒子(defective interfering particle)（ＤＩＰ）の存在という点からみて、大きな欠点をもつ。すなわち、ＤＩＰがバイオリアクター内に蓄積してウイルスレベルの変動を引き起こし、結果的に低い製造収率となる可能性がある。この作用はフォン・マグヌス作用(von Magnus effect)または継代作用(passage effect)としても知られている。２段階撹拌槽型バイオリアクター法は既にWO 89/08701に、ウイルスおよびウイルス抗原を調製するための方法およびデバイスに関して記載されている。Frensing and Heldt et al. PLoS ONE 2013 8(9):e72288により記載された従来技術は、インフルエンザウイルスが周期的なＤＩＰ蓄積を示し、おおよそ２．０～０．８ ｌｏｇ１０（ＨＡ単位／１００μＬ）の数値間で変動するヘマグルチニンウイルス力価（ＨＡ力価）を伴なうことを確認した。
【０００６】
Tapia and Vazquez et al.において確認されたように、多段階撹拌槽型バイオリアクターシステムを用いる連続法はウイルスのバッチ式製造に対する興味深い選択肢である。しかし、連続法の生産性はＤＮＡおよびＲＮＡウイルスの集団におけるＤＩＰの蓄積によって明らかに制限され、よって、これらのＤＩＰの存在は生成物力価を有意に低減し、よって製造プロセスに強い影響を及ぼす可能性がある。特に、カスケードの容器数が増加すればＤＩＰの存在の影響は増強されると思われる。すなわち、２段階撹拌槽型バイオリアクターシステムはむしろ多段階撹拌槽型バイオリアクターシステムに匹敵すると考えられ、よってウイルスワクチン製造プロセスを強化するための最良の選択肢であると思われる。しかし、３以上のＳＴＲの連続使用を伴なう多段階ＳＴＲシステムは、操作の複雑さのためプロセス損失のリスクが増大するので大規模ワクチン製造には受入れられないであろう。
【０００７】
先に、Hu, Y.C. et al., Cytotechnology, 1997, 24, 143-152は、組換えタンパク質の製造のために昆虫細胞に組換えバキュロウイルスを感染させるためのチューブ型シーケンシャルフローバイオリアクター(tubular sequential-flow bioreactor)を確定した。このシステムにおいて、昆虫細胞とバキュロウイルスをチューブにポンピングし、感染した細胞を採集し、ＰＢＳで洗浄し、感染動態試験のために細胞培養フラスコ（Ｔ－フラスコ）へ移した。それらの結果は、感染時間分布がチューブ内での感染によって増強される可能性があることを示唆した。それにもかかわらず、過度の細胞死およびチューブの入口における沈降が問題であり、操作を制限した。同様に、システムがチューブ内での組換えタンパク質の産生を持続させる能力、および長い操作時間のための安定操作などの問題は未解決のままである。
（中略）
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
よって、本発明の目的は、これらの細胞の培養に負の影響を及ぼすウイルス粒子、ベクターおよび他の分子の連続生産を可能にするバイオリアクターおよびバイオリアクターシステムを提供することである。
【００１１】
本発明の他の目的は、ウイルス粒子、ベクター、および他の分子、特に有毒分子を産生するための、当技術分野における欠点を克服する方法を提供することである。」
「【発明を実施するための形態】
【００１７】
第１態様において、本発明は、真核細胞の培養、および場合により感染、ウイルストランスダクションまたはトランスフェクションに適合した、少なくとも１つの入口および少なくとも１つの出口を備え、入口がチューブの第１端に存在し、出口がチューブの第２端に存在し、チューブの長さ－対－直径の比が少なくとも５０００：１、たとえば少なくとも１００００：１、特に少なくとも５００００：１であるインテグラルチューブまたはマルチパートチューブを有する、プラグフローチューブ型バイオリアクターに関する。
【００１８】
すなわち、本発明者らは、チューブの長さ－対－直径の比が少なくとも５０００：１のプラグフローチューブ型バイオリアクターを提供することにより、希望するウイルス粒子、ベクター、改質された細胞を含めた細胞、または有毒分子を含めた他の分子の産生を可能にするのに十分な期間、真核細胞を感染、ウイルストランスダクションまたはトランスフェクションさせることが可能であることを認識した。チューブ状デザインであるため、逆混合が起きる可能性を無視でき、よって、連続製造のＤＩＰ蓄積その他の欠点が避けられる。さらに、後代ウイルスにおける継代数延長による希望しない抗原性および変異原性の変動が最小限に抑えられる。すなわち、以下に記載する連続製造のための新規なバイオリアクターおよびバイオリアクターシステムにより、希望しない抗原性変動の蓄積が避けられ、フォン・マグヌス作用が制限される。このバイオリアクターを用いると、実質上、経時的に同一品質のウイルス収穫物を提供できる。」
「【００２１】
一般に、チューブはコイル状チューブ型バイオリアクターとして構築される。ある態様において、このコイル状チューブ型バイオリアクターまたはバイオリアクターは一般に、比重を利用するために骨組み内に垂直位置に支持され、それによれば入口は管の上部に、出口は底部に存在する。」
「【００２８】
例に記載する原型は、インフルエンザウイルスを産生し、１９および２１時間の滞留時間（ＲＴ）で操作された。このシステムをたとえば感染動態試験のために改変してＲＴを数時間に短縮できる（すなわち、ポンピング速度を高めるか、あるいはチューブの長さを短縮することによる）。インフルエンザより遅い速度で複製し、したがってチューブ内でのより長い滞留時間を必要とするウイルスの産生を可能にするために、ＲＴを延長することによりシステムを改変することもできる（すなわち、ポンピング速度を低下させるか、あるいはチューブの長さを延長することによる）。ウイルス粒子の感染および産生または希望する分子の発現を可能にするのに適したＲＴは当業者に周知である。」
「【００４６】
本発明による方法は、ウイルス粒子、ウイルスベクターを含めたベクター、改質された細胞を含めた細胞、または有毒分子を含めた他の分子を、真核細胞の培養により連続調製するために特に有用である。
【００４７】
本方法は、ワクチンなどに使用するための感染性ウイルス粒子を調製するのに特に有用である。特に、本方法は現在の技術の問題、すなわち経時的なＤＩＰの蓄積および希望しない抗原性変異を克服する。すなわち、本発明による方法では規定した継代数のウイルスストックについて感染が行なわれるので、希望しない抗原性変異およびフォン・マグヌス作用のリスクが避けられ、細胞の感染および増殖が起きる帯域におけるＤＩＰおよび後代ウイルスの保持も蓄積もない。
【００４８】
実際には、理想的なプラグフローは、チューブ内で放射拡散が優位であることおよびバックミキシングが無いことを特徴とする。したがって、本発明によるシステムにおいては、細胞はチューブの入口でウイルスストックにより、または少なくともその後の時点で隣接細胞が放出する後代ウイルスにより感染する可能性があるにすぎない。バックミキシングが実質的に存在しないことからみて、連続培養のための先行技術に記載された欠点は避けられる。
【００４９】
有毒分子の調製についても同じことが言える。先行技術によれば連続培養に際して有毒分子が蓄積するが、本発明によるプラグフローチューブ型バイオリアクターではバックミキシングが実質的に存在しないため、また放射拡散が優位であるため、有毒分子がそれの毒性を現わすのは、有毒分子を発現するあらゆる細胞において後の時点でチューブ型リアクターの終端においてであるにすぎない。
【００５０】
よって、本発明による方法は、ウイルスならびに産生される後代ウイルスおよびベクターにおける変動のリスクを低減し、かつ希望する生成物の産生および上清中へのそれの放出における負の影響をいずれも避けることができる。」
「【実施例】
【００５８】
実施例１
材料および方法
材料および方法
懸濁状態で増殖するＭａｄｉｎ Ｄａｒｂｙイヌ腎臓(Madin Darby canin kidney)（ＭＤＣＫ．ＳＵＳ２）細胞、およびインフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ Ｈ１Ｎ１（Ｒｏｂｅｒｔ Ｋｏｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＲＫＩ，ドイツ）ウイルスを用いて、実験を実施することができた。この実験は下記の２部に従って実施された：最初に２１時間のＲＴおよび感染ポイント(point of infection)（ＰＯＩ）におけるＭＯＩ０．００５、次いで１９時間のＲＴおよびＰＯＩにおけるＭＯＩ０．０１６。細胞を５×１０⁶個／ｍＬまで細胞バイオリアクター(cell bioreactor)（ＣＢ）内で増殖させ、連続モードに維持した。ＣＢのｐＨを７．１～７．３の値に維持した。ウイルスストック(virus stock)（ＶＳ）のｐＨを手動で７．０～７．５に制御した。培養中にＣＢの試料を採取して、ウイルス汚染が無いことを確認した。チューブの入口でＶＳの試料も採取して、ウイルス粒子濃度（ＨＡ力価）を測定した。収穫物を１２時間毎に採集して、出口におけるＨＡ力価を測定した。
【００５９】
結果および考察
ｐＨなどのパラメーターを手動制御しながらバイオリアクターを３週間操作した。最初の５日間の安定化期間後に、チューブの出口（収穫物）においてウイルス力価を観察することができ、５～１０日目に１．６ ｌｏｇ１０（ＨＡ単位／１００μＬ）に近いＨＡ値、後続日におおよそ２．５のＨＡ値であった（図３Ａ）。ウイルスストックのＨＡ力価はアッセイの検出限界未満であった（図３Ｂ）。したがって、収穫物において測定したＨＡ力価はチューブ型バイオリアクター内でのウイルス産生のみに相当する。同様に、ＣＢにおいてＨＡ力価がみられないことにより、この容器にウイルス汚染が無かったことが確認される（図３Ｂ）。」
「【図３ａ】
〔図省略〕
【図３ｂ】
〔図省略〕
」
「 【００６０】
３つの異なるバイオリアクターシステムについて得られたＡ型インフルエンザウイルス産生の実験データに基づいて、収量推定を行ない、表１にまとめた。チューブ型プラグフローバイオリアクター（連続ウイルス産生）についてバッチ培養より２．８倍高い空時収量(space-time yield)が推定され、定常状態操作（６～１２日）で総生産体積１０Ｌおよび安定ウイルス力価２．５ ｌｏｇ１０（ＨＡ単位／１００μＬ）と推測された。
【００６１】
表１．１０Ｌの生成物の産生についてのチューブ型プラグフローリアクター、２段階撹拌槽型およびバッチ式バイオリアクター間のウイルス収量の比較（５００ｍＬのＳＴＲ体積）
【００６２】
【表１】
〔図省略〕
【００６３】
実施例１は、本発明によるコイル状バイオリアクターの形態のプラグフローチューブ型バイオリアクターの有用性、ならびに本発明によるシステムおよび方法の有用性を立証する。感染性ウイルスだけでなく、たとえば遺伝子療法に有用なウイルスベクターを含めたベクターも得ることができるのは当業者に明らかである。さらに、このシステムは、抗体を含めた他の分子、または特に他の様式で宿主細胞に対して有毒である分子の発現および産生に有用である。よって、特に本発明によるシステムまたはバイオリアクターを用いる本発明による方法は、ウイルス粒子、ウイルスベクターを含めたベクターおよび有毒分子を含めた他の分子の調製を可能にする。多様なＨＡ力価がより劣る図１Ｃ右側に模式的に示したFrensing and Heldt et al. 2013などの先行技術と対照的に、図３に示すように、特におおよそ２．５ ｌｏｇ１０（ＨＡ単位／１００μＬ）の安定なウイルス力価を定常状態操作、たとえば１３～１６日の培養時間で提供できる。
【００６４】
さらに、排出ラインで得られた培養物の分析は、経時的なＤＩＰの蓄積または希望しない抗原性変異を伴なう他の何らかのウイルス蓄積が起きないことを示す。すなわち、このシステムは数週間にわたって作動することができる。さらに、シングルユースバイオリアクターの形態で、このシステムは感染性物質に使用でき、多種多様なタイプの感染性ウイルスの操作が可能である。」
(２) 引用文献２の記載事項及び引用発明の認定
ア 引用文献２に記載された事項
原査定の拒絶の理由において引用された、本願の出願前に発行された文献である「YU-CHEN HU et al.，A tubular segmented-flow bioreactor for the infection of insect cells with recombinant baculovirus，CYTOTECHNOLOGY，1997年，24(2)，143-152」（以下「引用文献２」という。）には、次の記載がある（括弧内に当合議体が作成した日本語訳を示した。また、当合議体により、後記イの引用発明の認定に直接用いる記載に下線を付した。）。
(ア) 「Abstract」
「A continuous process of insect cell （Sf9） growth and
baculovirus infection is tested with the sequential combination of
a CSTR and a tubular reactor. A tubular infection reactor enables
continuous introduction of baculovirus and therefore avoids the
‘passage effect’ observed in two-stage CSTR systems. Moreover,
a tubular reactor can be used to test cell infection kinetics and
the subsequent metabolism of infected insect cells. Unlike batch
and CSTR culture, cells in a horizontally positioned tubular
reactor settle due to poor mixing. We have overcome this problem
by alternately introducing air bubbles and media and by
maintaining a linear velocity sufficient to keep cells suspended.
This article addresses the development of the tubular reactor
and demonstrates its use as an infection system that
complements the two-stage CSTR.」
（昆虫細胞（Sf9）増殖及びバキュロウイルス感染の連続プロセスを、ＣＳＴＲ及び管型リアクターの連続的な組合せを用いて試験する。管状感染リアクターは、バキュロウイルスの連続導入を可能にし、したがって、２段階ＣＳＴＲシステムにおいて観察される「継代効果」を回避する。さらに、管状リアクターを使用して、細胞感染動力学及び感染昆虫細胞のその後の代謝を試験することができる。バッチ及びＣＳＴＲ培養とは異なり、水平に配置された管状リアクター中の細胞は、混合が不十分であるため沈降する。我々は、気泡と培地を交互に導入し、細胞を浮遊状態に保つのに十分な線速度を維持することによって、この問題を克服した。この論文は、管状リアクターの開発に取り組み、２段階ＣＳＴＲを補完する感染システムとしてのその使用を実証する。）
(イ) 「Introduction」の第１段落
「The baculovirus expression system is now established as a
powerful and versatile tool for the expression of a variety of
eucaryotic proteins. Not only does it provide for high-level
expression, but it performs post-translational processing such as
glycosylation and phosphorylation. There have been many
bioreactors proposed to grow insect cells and produce proteins
of interest, such as packed-bed bioreactors (Shuler et al., 1990)
, helical ribbon impeller bioreactors (Maiorella et al., 1988),
continuous stirred tank reactors (CSTR) with direct sparging (
Wang and Bentley, 1994), semicontinuous reactors (Hink and
Strauss, 1980) and two-stage bioreactors (de Gooijer et al., 1992;
Kompier et al., 1988; van Lier et al., 1990; van Lier et al.,
1992; van Lier et al., 1994) where the first CSTR is used for cell
growth and the second for viral infection and protein production.」
（バキュロウイルス発現系は、現在、種々の真核生物タンパク質の発現のための強力かつ多用途なツールとして確立されている。それは高レベルの発現を提供するだけでなく、グリコシル化及びリン酸化などの翻訳後プロセシングを行う。昆虫細胞を増殖させ、そして目的のタンパク質を産生するために提案された多くのバイオリアクター（例えば、充填床バイオリアクター（Shulerら、1990）、ヘリカルリボンインペラーバイオリアクター（Maiorellaら、1988）、直接スパージングを伴う連続撹拌槽リアクター（CSTR）（Wang及びBentley、1994）、半連続リアクター（Hink及びStrauss、1980）及び２段階バイオリアクター（de Gooijerら、1992；Kompierら、1988；van Lierら、1990；van Lierら、1992；van Lierら、1994）があり、ここで、第１のＣＳＴＲは、細胞増殖のために使用され、そして第２のＣＳＴＲは、ウイルス感染及びタンパク質産生のために使用される。）
(ウ) 「Introduction」の第２段落
「Tramper and co-workers demonstrated the two-stage CSTR for
β-galactosidase production, but also noted a rapid decrease in
production after four weeks of operation due to both the passage
effect and selective pressure common in CSTRs (de Gooijer et
al., 1992; van Lier et al., 1990; van Lier et al., 1992; van Lier
et al., 1994). The passage effect occurs in the infection reactor
and is characterized as defective interference caused by the
occurrence of deletion mutants of the virus (van Lier et al.,
1992; Wickham et al., 1991). These mutants may lack up to
40% of the viral genome and are therefore replicated faster than
the intact nonoccluded viruses (NOVs). It is hypothesized that
upon coinfection of a cell with defective and intact virus, the
faster growing mutants compete favorably for replication factors
and thus interfere with intact virus replication (de Gooijer et al.
, 1992; van Lier et al., 1992). Due to the differential in
replication rate, the intact NOVs are gradually eliminated from
the second reactor. To overcome this second-reactor instability,
Taticek and Shuler (1992) proposed a three-stage system with a
middle CSTR that serves as an infection reactor. Virus stock
solution is continually introduced into the middle reactor operating
with a residence time equivalent to that necessary for virus
infection. In this way, all cells are infected by intact NOVs prior
to the production reactor. Note, however, that a continuously
operated stirred vessel will have a residence time distribution with
the average residence time being the inverse of the dilution rate.
Even after two residence times, roughly 15% of the fluid
introduced remains in the vessel. Thus, there will be a finite
probability that some cells will be retained in the infection
reactor for a sufficiently long time that they begin to produce
progeny virus. This will again result in virus instability due to
the passage effect; a successful 3-stage system was not
reported. By incorporating a continuous flow of virus in a linear
reactor, specifically placed as an infection reactor between two
CSTR’s one may be able to circumvent the defective virus
instabilities noted by Tramper and co-workers (de Gooijer et al.
, 1992; van Lier et al., 1990; van Lier et al., 1992; van Lier et
al., 1994) and Taticek and Shuler (1992) because there will be
no retention of progeny virus in the reactor zones where
infection occurs.」
（Tramper及び共同研究者らは、β-ガラクトシダーゼ産生のための２段階ＣＳＴＲを実証したが、ＣＳＴＲにおいて一般的な継代効果及び選択圧の両方に起因して、４週間の運転後に産生が迅速に減少することの指摘も行った（de Gooijerら、1992；van Lierら、1990；van Lierら、1992；van Lierら、1994）。継代効果は、感染リアクター中で生じ、ウイルスの欠失変異体の出現によって引き起こされる欠陥干渉として特徴付けられる（van Lierら、1992；Wickhamら、1991）。これらの変異体は、ウイルスゲノムの４０％までを欠くことがあり、そのため、完全な非閉塞性ウイルス（ＮＯＶ）よりも速く複製される。欠陥ウイルス及び完全なウイルスの細胞との同時感染の際に、より速く増殖する変異体は、複製因子について有利に競合し、そのため、完全なウイルスの複製を妨害すると考えられている（de Gooijerら、1992；van Lierら、1992）。複製速度の差に起因して、完全なＮＯＶは、第２のリアクターから徐々に排除される。この第２のリアクターの不安定性を克服するために、Taticek及びShuler（1992年）は、感染リアクターとして働く中間ＣＳＴＲを有する３段階システムを提案した。ウイルスストック溶液を、ウイルス感染に必要な滞留時間と同等の滞留時間で運転する中間リアクターに連続的に導入する。このようにして、全ての細胞は、産生リアクターの前に完全なＮＯＶによって感染される。しかしながら、連続的に運転される撹拌容器は、平均滞留時間が希釈率の逆数である滞留時間分布を有することに留意が必要である。二つの滞留時間の後でも、導入された流体の約１５％が容器内に残る。したがって、相当の数の細胞が子孫ウイルスを産生し始めるのに十分に長い時間で感染リアクターに保持されることに有限の確率が存在するだろう。この場合も、継代効果に起因するウイルス不安定性を生じ、成功した３段階システムは報告されていなかった。特に二つのＣＳＴＲの間に感染リアクターとして配置された線形リアクター内にウイルスの連続流を組み込むことによって、感染が起こるリアクター領域内に子孫ウイルスが保持されないので、Tramper及び共同研究者（de Gooijer et al.,1992；van Lier et al.,1990；van Lier et al.,1992；van Lier et al.,1994）並びにTaticek及びシュラー（Shuler）（1992）によって指摘された欠陥ウイルスの不安定性を回避することができ得る。）
(エ) 「Introduction」の第３段落
「In this article, we report on a two-stage bioreactor system
consists of an upstream CSTR that provides cells continuously to
a downstream tubular reactor with segmented plug flow for
viral infection. Virus stock solution is introduced at the
beginning of the tubular reactor which was run with a mean
residence time of up to 10.3 hours. The infection process can
be monitored by taking samples at different distances down
the tubular reactor. Although evaluated for viral infection, by
operating at longer residence times the reactor could
potentially be used to monitor changes in cell physiology
during the infection and protein production phases. In
addition to describing the infection process, we report on
]practical constraints that we encountered.」
（この論文において、我々は、ウイルス感染のためのセグメント化されたプラグフローを有する下流の管状リアクターに細胞を連続的に提供する上流のＣＳＴＲからなる２段階バイオリアクターシステムについて報告する。ウイルスストック溶液を、１０．３時間までの平均滞留時間で運転した管状リアクターの最初に導入する。感染プロセスは、管状リアクターの下方の異なる距離で試料を採取することによってモニターすることができる。ウイルス感染について評価されたが、より長い滞留時間で運転することによって、リアクターは、感染及びタンパク質産生段階の間の細胞生理学における変化をモニターするために潜在的に使用され得る。感染プロセスを説明することに加えて、我々が遭遇した実用上の制約について報告する。）
(オ) 「Materials and methods」の「Bioreactor setup」
「Bioreactor setup
The overall reactor consists of two parts, a CSTR and a tubular
reactor. The CSTR is composed of a glassblown jacketted
spinner flask shown in Figure 1 as described previously （
Wang and Bentley, 1994）. The CSTR temperature was
maintained at 28 °C using a circulating water batch （VWR）
. The headplate consisted of a rubber stopper （No. 10）
drilled with seven holes for stirring, media inlet, level control,
vent, sampling, gas flow, and cell outlet. Experiments were
performed in two sets: the first utilized a vertical exit port in
the rubber stopper headplate. For the second, the reactor was
modified so that the exit port protruded from the side of the
reactor at 45 °angle downward from the vertical.（当審注：原文では「45 °C」と記載されているが、角度を意味することが明らかであるから、合議体にて「45 °」に修正した。）
The tubular reactor was comprised of a microprocessor-
controlled peristaltic pump with six rollers （Watson Marlow,
model 505Du） which could be operated as slowly as 0.2 rpm
while accommodating a 4-channel pumphead （model 205BA
） and MasterFlex no. 14 silicone tubing （length = 7.6 m, ID
= 1.6 mm）. The long tube was coiled as a series of concentric
circles in a horizontal plane and placed in a laminar flow hood.
Unless otherwise noted, the entrance and exit of the tubular
reactor were used as the sampling points shown in Figure 1.
Watson-Marlow silicone tubing （ID=1.14mm）was used for
precise pumping of air into the tubular reactor through a Y-
junction in the inlet line. The pH was not controlled because
under the operating conditions the insect cell medium has a
strong buffer capacity and the pH does not change
significantly. As the normal insect cell growth temperature is
room temperature, no additional temperature control was
needed other than placing the tubular reactor in the hood.
Note, the CSTR was maintained at 28 °C by a water jacket.
In all experiments, the CSTR （working volume = 200 ml）
was operated without air sparging at a dilution rate of 0.0315
hr⁻¹ as previously decribed （Wang and Bentley, 1994）.」
（バイオリアクター装置
リアクター全体は、ＣＳＴＲ及び管状リアクターの二つの部分からなる。ＣＳＴＲは、前の論文で説明したように（Wang and Bentley,1994）、図１に示されるガラス吹きジャケット付きスピナーフラスコから構成される。循環水バッチ（ＶＷＲ）を使用してＣＳＴＲ温度を２８℃に維持した。ヘッドプレートは、撹拌、媒体入口、レベル制御、ベント、サンプリング、ガス流及び細胞出口のための七つの穴が開けられたゴム栓（No.10）で構成された。実験は二つのセットで実施した。第１のセットは、ゴム栓ヘッドプレートの垂直出口ポートを利用した。第２のセットに、出口ポートが垂直から下方に４５度の角度でリアクターの側面から突出するように、リアクターを改変した。
管状リアクターは、４チャネルポンプヘッド（モデル205BA）を収容しながら、０．２ｒｐｍ程度にゆっくりと運転することができる六つのローラーを有するマイクロプロセッサ制御ペリスタポンプ（Watson Marlow、モデル505Du）及びMasterFlex no.14シリコーン管（長さ=７．６ｍ、内径＝１．６ｍｍ）から構成された。この長い管を水平面内の一連の同心円として巻き、層流フード内に配置した。特に明記しない限り、管状リアクターの入口及び出口を図１に示すサンプリング点として使用した。Watson-Marlowシリコンチューブ（内径＝１．１４ｍｍ）を使用して、入口ラインのＹ接合部を通じて管状リアクター内に空気を正確にポンピングした。運転の条件下においては、昆虫細胞培地は強い緩衝能を有し、ｐＨは有意に変化しないため、ｐＨを制御しなかった。通常の昆虫細胞の成長温度は室温であるため、フード内に管状リアクターを配置する以外には追加の温度制御は必要なかった。ＣＳＴＲを水ジャケットによって２８℃に維持したことに注意が必要である。全ての実験において、ＣＳＴＲ（作業容量＝２００ｍｌ）を、前の論文で説明したように（Wang及びBentley、1994）、０．０３１５ｈｒ⁻¹の希釈速度でエアスパージングなしで運転した。）
(カ) Figure 1
「
〔図省略〕
Figure 1. Schematic diagram of the CSTR-tubular two-stage
bioreactor system. The expanded panel of the tubular reactor
illustrates the bubble/liquid flow pattern and the expected
velocity profile in the liquid segment.」
(図１ ＣＳＴＲ－管状２段階バイオリアクターシステムの概略図。管状リアクターの拡大パネルは、気泡／液体流パターン及び液体セグメント中の予想速度プロファイルを示す。)
(キ) 「Materials and methods」の「Baculovirus infection」
「To test the infection efficiency in the tubular reactor, virus
stock solution was introduced at the reactor entrance at an
MOI of ≒60 （controlled by fixing the flow rate ratio of cells
and virus stock solution）. Infection was evaluated at three
dilution rates （residence times τ = 1.6, 3.2 and 5.1 hrs）.
Infected cells from the tubular reactor were collected and
washed with PBS, resuspended in fresh medium, and
incubated in a 25 cm2 T-flask at 27 °C for later measurement.
A control was performed by taking the same number of cells
directly from the CSTR and infecting at the same MOI in a
T-flask where they were shaken for a time corresponding to
the residence time in the tubular reactor, and then washed in
the same manner as the previous cells and incubated until
later measurement. This procedure was repeated six times for
measurements of β-galactosidase at 72, 96, 120, 144, 168,
and 192 hrs post-infection. As noted above, the residence time
was then changed to 3.2 and 5.1 hrs and the above
experiments were repeated. （当審注：「≒」は、原文では、「～」が上下に並んだ記号。）」
（バキュロウイルス感染
管状リアクターにおける感染効率を試験するために、ウイルスストック溶液を、ＭＯＩ≒６０でリアクターの入口に導入した（細胞及びウイルスストック溶液の流速比を固定することによって制御した）。感染を三つの希釈率（滞留時間τ＝１．６、３．２及び５．１時間）で評価した。管状リアクターから感染細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄し、新鮮な培地に再浮遊して、後の測定のために２５ｃｍ²のＴフラスコ中において２７℃でインキュベートした。対照は、同数の細胞をＣＳＴＲから直接採取し、Ｔフラスコ中で同じＭＯＩで感染させ、管状リアクター中の滞留時間に対応する時間振盪し、次いで前の細胞と同じ方法で洗浄し、後の測定までインキュベートすることによって実施した。感染後７２、９６、１２０、１４４、１６８及び１９２時間でβ-ガラクトシダーゼを測定するために、この手順を６回繰り返した。上記のように、次いで滞留時間を３．２時間及び５．１時間に変更し、上記の実験を繰り返した。）
(ク) 「Results and discussion」の「Reactor Dynamics - no
infection」における第１～３段落
「Figure 3（A） and （B） show the time-course of cell
density at the entrance and the exit of the tubular reactor run
without virus stock addition. As stated previously, air bubbles
were introduced for aeration and to assist in driving the cells
down the tubular reactor. In this way, we taken advantage of
bubble surface tension in addition to the liquid convective flow
to propel the cells down the tube. In addition, since the
Reynolds number is of order 1 （see Table 1）, we expect a
viscous flow profile that will maintain or continually resuspend
cells in the liquid element （see Figure 2）.
The measured cell density difference between the entrance
and the exit was negligible, indicating that the bubbles created
a segmented flow effective in carrying the cells. From our visual
observations, at the flow rates indicated, no significant settling
occurred. Note that several tube diameters, liquid flow rates
and air flow rates were attempted before we were able to
demonstrate effective segmented flow without cell settling along
the length of the tube. Additionally, the success of this reactor
hinges on the controlled introduction of equally spaced air
bubbles; without bubbles, we were unable to keep cells
suspended for the reactor’s length （7.6 m）.
Besides ensuring the segmented flow profile, air bubbles also
provide oxygen, an essential nutrient for the cells. Indeed, since
there is such close contact between cells and air, we expect no
oxygen limitation; the consistency of lactate level shown in
Figure 3（C） confirms our assumption. Also, the glucose level
in the medium was measured at the entrance and exit of the
tubular reactor. As shown in Figure 3（C）, the glucose
concentration was consistently higher than 15 mM, and was not
limiting.」
（図３（Ａ）及び（Ｂ）は、ウイルスストック添加なしで運転した管状リアクターの入口及び出口における細胞密度の時間経過を示す。前述のように、曝気のために気泡を導入し、細胞を管状リアクターの後方に移動させるのを補助した。このようにして、我々は、液体の対流に加えて気泡の表面張力を利用して、細胞をチューブの後方に進ませた。さらに、レイノルズ数はオーダー１であるので（表１を参照のこと）、我々は、液体要素中に細胞を維持又は連続的に再浮遊する粘性流動プロファイルを予測する（図２を参照のこと）。
入口と出口との間で測定された細胞密度の差は無視できるものであり、気泡が細胞を運ぶのに有効なセグメント化された流れを生成したことを示している。我々の視覚的観察から、示された流速では、有意な沈降は起こらなかった。チューブの長さに沿って細胞が沈降することなく効果的なセグメント化された流れを実証することができた前提として、いくつかのチューブ直径、液体流量及び空気流量を試みたことに留意されたい。さらに、このリアクターの成功は、等間隔の気泡の制御された導入に依存しており、気泡なしでは、我々は、リアクターの長さ（７．６ｍ）にわたって細胞を浮遊状態に維持することができなかった。
気泡は、セグメント化された流れプロファイルを確保することに加えて、細胞にとって必須の栄養素である酸素も提供する。実際に、細胞と空気の間にはそのような密接な接触が存在するので、我々は、酸素制限を予想しない。図３（Ｃ）に示される乳酸レベルの一貫性は、我々の仮定が妥当であることを裏付ける。また、培地中のグルコースレベルを管状リアクターの入口及び出口で測定した。図３（Ｃ）に示されるように、グルコース濃度は一貫して１５ｍＭより高く、制限されていなかった。）
(ケ) Figure 3
「
〔図省略〕
Figure 3. Cell density versus time in (A) set I and (B) set II.
Vertical lines denote different residence times. Symbols include
: (○), density at the exit of the tubular reactor; (●), density at
the entrance of the tubular reactor; (◇), viability at the exit of
the tubular reactor. Panel (C) indicates glucose and lactate
concentrations at the entrance (●) and exit (◇) of the reactor
for the experiment shown in Panel (A). RT is the residence time.」
（図３ （Ａ）セットＩ及び（Ｂ）セットＩＩにおける細胞密度対時間。
垂直な線は異なる滞留時間を示す。記号は以下を含む:（○）は管状リアクターの出口における密度;（●）は管状リアクターの入口における密度;（◇）は管状リアクターの出口における生存率。パネル（Ｃ）は、パネル（Ａ）に示される実験についてのリアクターの入口（●）及び出口（◇）におけるグルコース及び乳酸塩の濃度を示す。ＲＴは滞留時間である。）
(コ) 「Results and discussion」の「Reactor Dynamics - no
infection」における第６、７段落
「The mean cell density for each pseudo-steady state is
depicted as a function of residence time in Figure 4（A）. For
comparison, we have also depicted the cell densities in the
CSTR for both experiment sets as a function of time after
reaching the first pseudo-steady state. The cell densities in
the CSTR for both sets were roughly similar, varying from 7 to
7.5×10⁵ cells/mL. A lower residence time in the tubular
reactor resulted in a higher viable cell density at the reactor
exit. At lower residence times （higher liquid shear）, there
was less accumulation of cells prior to the pump inlet as
expected. Note also that the average cell density in set II （
angled withdrawl port） was slightly higher than in set I （
vertical withdrawl port）; again illustrating the advantage of a
downward sloping withdrawl port in ensuring similar cell
densities as the CSTR.
We repeated these experiments for four mean residence
times, all the data obtained were compiled into Figure 4（B）
where cell density is depicted as a function of linear velocity.
Our results suggest that cells settled more at low linear
velocity and settled significantly once the linear velocity
dropped below 2 cm/min.（後略）」
（各擬似定常状態の平均セル密度を滞留時間の関数として図４（Ａ）に示す。比較のために、我々は、両方の実験セットについてのＣＳＴＲ中の細胞密度も、最初の偽定常状態に達した後の時間の関数として示した。両セットのＣＳＴＲ中の細胞密度はほぼ同様であり、７～７．５×１０⁵細胞/mLの範囲であった。管状リアクターにおけるより短い滞留時間は、リアクター出口でより高い生存細胞密度をもたらした。より短い滞留時間（より高い液体剪断）では、予想されたように、ポンプ入口前の細胞の蓄積がより少なかった。セットII（傾斜引き出しポート）における平均セル密度は、セットI（垂直引き出しポート）におけるものよりもわずかに高かったことにも留意されたい。これもまた、ＣＳＴＲと同様のセル密度を確保することについての下向き傾斜引き出しポートの利点を示す。
我々は、これらの実験を四つの平均滞留時間について繰り返し、得られた全てのデータを細胞密度を線速度の関数として示す図４（Ｂ）にまとめた。我々の結果は、細胞が低い線速度でより多く沈降し、線速度が２ｃｍ／分未満に低下すると有意に沈降したことを示唆する。（後略））
(サ) Figure 4
「
〔図省略〕
Figure 4. Panel (A): Mean cell density at the exit during pseudo
-steady state versus residence time. Panel (B): the relationship
between cell density and linear velocity in the tubular region.」
（図４ パネル（Ａ）:擬似定常状態中の出口における平均セル密度対滞留時間。パネル（Ｂ）:管状領域における細胞密度と線速度との関係。）
(シ) 「Infection and expression」の第１段落
「Infection was initiated by the introduction of virus and cells
at the entrance of the tubular reactor. As described in the
Methods section, the experimental control was provided by
cells taken directly from the CSTR and infected in a T-flask.
During these experiments, we changed the ratio of air and
liquid so that the profile looked more like sections of liquid film
traversing along between air bubbles. As discussed previously,
we have taken precautions to avoid oxygen and/or glucose
limitation. The MOI was controlled by fixing the flow rate ratio
of virus solution and cells. Also, we ran the reactor at high MOI
(≒（60) to ensure that all cells were infected by primary
infection. Consequently, infection efficiency is determined by
the increase in activity of β-galactosidase relative to the
control. Figure 5(A) shows the cell density curve in the tubular
reactor exit while conducting the infection experiments. Note
that the cell densities were stable for at least seven residence
times prior to sampling so that a well established flow pattern
for infection was evaluated. Panel (B) shows the time course
of β-galactosidase activity for cells infected in both the tubular
reactor and T-flask at three different residence or infection
times. The yield of β-galactosidase was consistently higher
from the cells infected in the tubular reactor, thus the infection
of cells in the tubular reactor was comparable to or better
than cells infected in T-flasks.（当審注：「≒」は、原文では、「～」が上下に並んだ記号。）」
（感染は、管状リアクターの入口でウイルス及び細胞を導入することによって開始した。方法の節に記載したように、実験対照は、ＣＳＴＲから直接採取され、Ｔフラスコ中で感染させた細胞によって提供された。これらの実験中、我々は、プロファイルが気泡間を通過する液膜の断片のように見えるように、空気と液体の比を変化させた。前述のように、我々は、酸素及び/又はグルコースの制限を回避するために注意を払った。ＭＯＩは、ウイルス溶液と細胞の流速比を固定することによって制御した。また、我々は、全ての細胞が一次感染によって感染されたことを確実にするために、高いＭＯＩ（≒６０）でリアクターを運転した。結果的に、感染効率は、対照に対するβ-ガラクトシダーゼの活性の増加によって決定される。図５（Ａ）は、感染実験を行っている間の管状リアクター出口における細胞密度曲線を示す。細胞密度は、サンプリング前の少なくとも七つの滞留時間にわたって安定していたため、感染に対する十分に確立されたフローパターンが評価されたことに留意されたい。パネル（Ｂ）は、三つの異なる滞留時間又は感染時間で、管状リアクター及びＴフラスコの両方において感染された細胞についてのβ-ガラクトシダーゼ活性の時間経過を示す。β-ガラクトシダーゼの収率は、管状リアクター中で感染させた細胞から一貫してより高く、したがって、管状リアクター中での細胞の感染は、Ｔフラスコ中で感染させた細胞に匹敵するか、又は、それより良好であった。）
(ス) 「Infection and expression」の第２段落
「Our results also indicate that at lower residence times,
primary infection was incomplete in both the tubular and T-flask
reactors. This can be seen in Figure 5（B） by lower β-gal yield
in the 1.6 hr experiment than in the others. At higher
residence times for the tubular reactor （= 3.2 and 5.1 hr）,
there were no significant differences in either the rate of
increase or the level of β-gal activity, indicating that the
infection process was completed prior to 3.2 hours
postinfection. On the other hand, the T-flask measurements
rose slightly from the 3.2 to 5.1 hr infection experiments,
suggesting infection was still incomplete at 3.2 hrs. Normally,
there is no shaking upon infection in T-flasks, our
experiments were done with slow shaking which would
provide better mixing and distribution of virus particles upon
infection than in normal T-flasks infection. Thus, these results
indicate that the infection in the tubular reactor was superior
to the T-flask, likely due to the intimate contact of the cells and
virus.」
（我々の結果は、より短い滞留時間では管型リアクター及びＴフラスコリアクターの両方において一次感染が不完全であったことも示す。これは、図５（Ｂ）において、１．６時間の実験におけるβ-ガラクトシダーゼの収率が他の実験よりも低いことによって見ることができる。管型リアクターのより長い滞留時間（＝３．２及び５．１時間）では、β-ガラクトシダーゼ活性の増加速度又はレベルのいずれにも有意な差はなく、感染プロセスが感染後３．２時間前に完了したことを示している。一方、Ｔフラスコ測定は、３．２～５．１時間の感染実験からわずかに上昇しており、感染が３．２時間でまだ不完全であることを示唆している。通常、Ｔフラスコで感染させる際に振盪はなく、我々の実験は、通常のＴフラスコ感染におけるよりも感染の際にウイルス粒子のより良好な混合及び分布を提供するゆっくりとした振盪で行った。したがって、これらの結果は、管状リアクターにおける感染が、おそらく細胞とウイルスとの密接な接触に起因して、Ｔフラスコよりも優れていたことを示す。）
(セ) Figure 5
「
〔図省略〕
Figure 5. Panel (A): the cell density in the tubular reactor when
conducting infection experiments. Panel (B): time course of
β-gal activity in cells infected for different residence times: (○
),β-gal yield for cells infected in T-flasks; (●), β-gal yield
for cells infected in the tubular reactor. For both infection
protocols, cels were washed in PBS and resuspended in fresh
media during the expression stage. RT is the residence time.」
（図５ パネル（Ａ）:感染実験を行ったときの管状リアクター内の細胞密度。パネル（Ｂ）:異なる滞留時間で感染させた細胞におけるβ-ガラクトシダーゼ活性の時間経過:（○）はＴフラスコ中で感染させた細胞についてのβ-ガラクトシダーゼ収率;（●）は管状リアクター中で感染させた細胞についてのβ-ガラクトシダーゼ収率。両方の感染プロトコルについて、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、そして発現段階の間に新鮮な培地中に再浮遊した。ＲＴは滞留時間である。）
(ソ) 「Infection and expression」の第４段落
「In summary, the infection of insect cells was demonstrated in
a linear segmented flow bioreactor. Less than 3 hours was
needed for complete infection at MOI 60. Although not tested,
we expect this reactor could be operated for longer residence
times at the same linear velocity （≧2 cm/min）, so that cell
metabolism could be effectively elucidated during the post-
infection period.（後略）（当審注：「≧」は、原文では、「＞」の下に「－」が並んだ記号。）」
（要約すると、昆虫細胞の感染が、線形セグメント化フローバイオリアクターにおいて実証された。ＭＯＩが６０で完全に感染させるのに必要な時間は、３時間未満であった。試験されていないが、我々は、このリアクターが同じ線速度（約２ｃｍ/分）でより長い滞留時間にわたって運転され得、その結果、細胞代謝が感染後の期間の間に効果的に解明され得ることを期待する。）
イ 引用発明の認定
前記アに摘記した引用文献２の記載事項を総合すると、引用文献２には、【Figure 1】に係る次の発明（以下「引用発明」という。）が記載されていると認められる。なお、認定の根拠となる記載箇所を括弧内に示した。
＜引用発明＞
「昆虫細胞（Sf9）増殖及びバキュロウイルス感染の連続プロセスを、ＣＳＴＲ及び管型リアクターの連続的な組合せを用いて試験するための、（「Abstract」）
ウイルス感染のためのセグメント化されたプラグフローを有する管状リアクターであって、（「Introduction」の第３段落）
２段階ＣＳＴＲシステムにおいて観察される「継代効果」を回避するものであり、（「Abstract」）
より長い滞留時間で運転することによって、感染及びタンパク質産生段階の間の細胞生理学における変化をモニターするために使用され得るものであり、（「Introduction」の第３段落）
４チャネルポンプヘッド（モデル205BA）を収容しながら、０．２ｒｐｍ程度にゆっくりと運転することができる六つのローラーを有するマイクロプロセッサ制御ペリスタポンプ（Watson Marlow、モデル505Du）及びMasterFlex no.14シリコーン管（長さ=７．６ｍ、内径＝１．６ｍｍ）から構成され、（「Bioreactor setup」）
この長い管を水平面内の一連の同心円として巻き、層流フード内に配置して、その入口及び出口をサンプリング点として使用し、（「Bioreactor setup」）
気泡と培地を交互に導入し、細胞を浮遊状態に保つのに十分な線速度を維持することによって、水平に配置された管状リアクター中の細胞は、混合が不十分であるため沈降する問題を克服したものであり、（「Abstract」）
気泡は、セグメント化された流れプロファイルを確保することに加えて、細胞にとって必須の栄養素である酸素も提供するものであり、（「Reactor Dynamics - no infection」の第３段落）
昆虫細胞培地は、強い緩衝能を有し、ｐＨは有意に変化しないため、ｐＨを制御しておらず、（「Bioreactor setup」）
昆虫細胞の成長温度は室温であるため、フード内に管状リアクターを配置する以外には追加の温度制御は必要なく、（「Bioreactor setup」）
ＭＯＩが６０で完全に感染させるのに必要な時間は、３時間未満である、（「Infection and expression」の第４段落）
管状リアクター。」
(３) 引用文献７の記載事項及び周知技術Ａの認定
ア 引用文献７に記載された事項
原査定の拒絶の理由において引用された、本願の出願前に発行された文献である特開平９－１２１８３５号公報（以下「引用文献７」という。）には、次の記載がある。なお、下線は当合議体が付したものであり、以下同様である。
「【０００２】
【従来の技術】
…（中略）…
【０００６】４．設置面積縮小のために、反射板を設けた円筒体にチューブを螺旋状に巻いて設置したチューブラ型フォトバイオリアクタも提案されている。（Europian Patent Application number 87301955.8 ）。」
「【００１６】（実験例１）図３は、本発明の第３の実施例であるチューブラ型フォトバイオリアクタの断面図である。円錐体底面の直径が１５０cm、円錐体上部を切り取った台形部上面の直径が４０cmである円錐体の架台６に直径５cm、長さ５０ｍからなる透明塩化ビニル性のチューブ２を、３cmづつ間隔を開け、反射板７との距離を７．５cmとして、螺旋状に一重巻きにしてチューブラ型リアクタの培養槽１とした。チューブ２内には、藻体が分散している培養液が循環する。上記の培養槽１の円錐体の架台６内部に、内径３０cm、高さ１００cmの円筒型のＣＯ2 吸収塔１９を設置した。ＣＯ2吸収塔１９内のスパージャ８からＣＯ2混合ガス１１を微細気泡として出し、ＣＯ2を吸収した培養液はポンプ１４で培養槽１のチューブ２の下端部に導入させ、上端部からＣＯ2吸収塔１９へ戻る。チューブ２内の線速度はガスの流量により、０から３３cm／ｓの範囲でとれる。流速は流量センサー１５で測定する。チューブ２内を移動する間に光合成は行われ、藻体は培養液中のＣＯ2を固定化し増加する。チューブ２の出口側にはｐＨ計１６、溶存酸素計１７、温度計１８が設置され、培養液の組成変化を監視して最適条件に制御する。（後略）」
「【図３】
〔図省略〕
」
「【００１８】図４に、本発明の第４の実施例であるチューブラ型フォトバイオリアクタの断面図を示す。チューブ２を円錐体側面に螺旋状に設置した培養槽１に、気泡ポンプ３を用いて培養液を循環させるものである。透明なチューブ２は、円錐体の架台６に螺旋状に巻き付けてチューブラ型リアクタの培養槽１とした。培養液は気泡ポンプ３を用いて培養槽１とライザー部４との間を循環する。ライザー部４で上昇した培養液は、円錐型の培養槽１の上部から下部へと下降し、その後ライザー部４の下部へ導かれる。藻体は培養液中に懸濁状態で存在し、培養槽１で受光して光合成反応は進行する。ライザー部４に導入された溶液中の溶存酸素はライザー部４のＣＯ2混合ガス１１による曝気作用により除去される。（後略）」
「【図４】
〔図省略〕
」
イ 周知技術Ａの認定
前記アに示した引用文献７の摘記事項に例示されているように、次の技術事項は、当業者にとって周知技術であったと認められる。（以下「周知技術Ａ」という。）
＜周知技術Ａ＞
「チューブ状のバイオリアクターを、螺旋状に巻いた状態で、一端が鉛直方向上部に、他端が鉛直方向下部に配置されるように円筒体又は円錐体に支持させること。」
(４) 本件補正発明と引用発明の対比
ア 対比分析
本件補正発明と引用発明を対比する。
(ア) 構成Ｘ１の観点（「プラグフローチューブ型バイオリアクター」）
「プラグフローチューブ型バイオリアクター」の発明である本件補正発明と「ウイルス感染のためのセグメント化されたプラグフローを有する管状リアクター」の発明である引用発明は、「プラグフローチューブ型バイオリアクター」の発明である点において一致する。
(イ) 構成Ａの観点
ａ 構成Ａは、「真核細胞の培養、および感染、ウイルストランスダクションまたはトランスフェクションに適合した」ものであることである。
ｂ(ａ) 引用発明が次のｉからiiiの構成を備えることを踏まえると、引用発明における「管状リアクター」は、昆虫細胞が代謝を行う環境が維持されているといえる。
ｉ 「管状リアクター」に「気泡と培地を交互に導入」しており、「気泡は」「細胞にとって必須の栄養素である酸素も提供するものであ［る］」こと。
ii 「昆虫細胞培地は、強い緩衝能を有し、ｐＨは有意に変化しない」ものであること。
iii 「昆虫細胞の成長温度は室温であるため、フード内に管状リアクターを配置する以外には追加の温度制御は必要な」いこと。
(ｂ) そうすると、引用発明の「管状リアクター」は、昆虫細胞が代謝を行う環境が維持されているといえるから、本件補正発明の「真核細胞の培養」「に適合した」に相当する構成を備えるといえる。
ｃ(ａ) また、引用発明の「管状リアクター」は、「ウイルス感染のための」ものであり、「ＭＯＩが６０で完全に感染させるのに必要な時間は、３時間未満である」ため、真核細胞の感染を行うのに必要な構成を備えているといえる。
(ｂ) そうすると、引用発明は、本件補正発明の「真核細胞の」「感染」「に適合した」に相当する構成を備えるといえる。
ｄ 前記ｂ及びｃを踏まえると、引用発明は、「真核細胞の培養、および感染、ウイルストランスダクションまたはトランスフェクションに適合した」との要件を充足するといえる。
ｅ したがって、本件補正発明と引用発明は、次の点において一致する。
「真核細胞の培養、および感染、ウイルストランスダクションまたはトランスフェクションに適合した」ものである点。
(ウ) 構成Ｂの観点
ａ 構成Ｂは、「少なくとも１つの入口および少なくとも１つの出口を備え、入口がチューブの第１端に存在し、出口がチューブの第２端に存在し［ている］」ことである。
ｂ 引用発明において、「管を」「層流フード内に配置して、その入口及び出口をサンプリング点として使用」するところ、「管」の「入口」及び「出口」は、本件補正発明の「チューブ」の「入口」及び「出口」に相当する。
ｃ また、引用発明において、「入口」が「管」の一端、「出口」が「管」の他端に存在することは明らかである。
ｄ 前記ｂ及びｃの検討結果をまとめると、本件補正発明と引用発明は、次の点において一致する。
「少なくとも１つの入口および少なくとも１つの出口を備え、入口がチューブの第１端に存在し、出口がチューブの第２端に存在し」ている点。
(エ) 構成Ｃの観点
ａ 構成Ｃは、「チューブの長さ－対－直径の比が少なくとも５０００：１であるチューブを有し」たものであることである。
ｂ 引用発明の「管状リアクター」は「MasterFlex no.14シリコーン管（長さ=７．６ｍ、内径＝１．６ｍｍ）」を含んでおり、当該シリコーン管のチューブの長さ－対－直径の比は、４７５０：１である。
ｃ 前記ｂを踏まえると、本件補正発明と引用発明は、構成Ｃの観点において、次の(ａ)の点において一致し、後記(ｂ)の点において相違する。
(ａ) 構成Ｄの観点での一致点
「チューブの長さ－対－直径の比が少なくとも４７５０：１であるチューブを有し」たものである点。
(ｂ) 構成Ｄの観点での相違点
チューブの長さ－対－直径の比が、
本件補正発明においては、「少なくとも５０００：１である」のに対して、
引用発明においては、４７５０：１である点。
(オ) 構成Ｄの観点
ａ 構成Ｄは、「チューブがコイル状チューブであ」ることである。
ｂ 引用発明の「管型リアクター」は、「長い管を水平面内の一連の同心円として巻［いた］」ものを含むから、本件補正発明において「チューブがコイル状チューブであ［る］」ことと、「チューブが巻回された形状のチューブであ［る］」点において共通する。
ｃ したがって、本件補正発明と引用発明は、構成Ｄの観点において、次の(ａ)の点において一致し、後記(ｂ)の点において相違する。
(ａ) 構成Ｄの観点での一致点
「チューブが巻回された形状のチューブであ［る］」点。
(ｂ) 構成Ｄの観点での相違点
チューブの巻回された形状の態様が、
本件補正発明においては、「コイル状」であるに対して、
引用発明においては、水平面内の一連の同心円として巻かれたものである点。
(カ) 構成Ｅの観点
ａ 構成Ｅは、「前記細胞およびウイルスが、細胞のウイルス感染、ウイルストランスダクションまたはトランスフェクションを維持するのに十分な時間チューブ内で保持されている」ことである。
ｂ(ａ) 引用発明の「管状リアクター」は、「ウイルス感染のための」ものであり、「ＭＯＩが６０で完全に感染させるのに必要な時間は、３時間未満である」ため、昆虫細胞がウィルス感染を行うのに十分な時間、昆虫細胞及びバキュロウィルスを管状リアクター内に保持するものであることは明らかである。
(ｂ) そうすると、引用発明は、本件補正発明の「前記細胞およびウイルスが、細胞のウイルス感染」「を維持するのに十分な時間チューブ内で保持されている」に相当する構成を備えるといえる。
(ｃ) そのため、引用発明は、「前記細胞およびウイルスが、細胞のウイルス感染、ウイルストランスダクションまたはトランスフェクションを維持するのに十分な時間チューブ内で保持されている」という要件を充足するといえる。
ｃ したがって、本件補正発明と引用発明は、次の点において一致する。
「前記細胞およびウイルスが、細胞のウイルス感染、ウイルストランスダクションまたはトランスフェクションを維持するのに十分な時間チューブ内で保持されている」点。
イ 一致点及び相違点の認定
前記アの対比分析の検討結果をまとめると、本件補正発明と引用発明は、次の(ア)に示す一致点において一致し、後記(イ)に示す相違点において相違すると認められる。
(ア) 一致点
「真核細胞の培養、および感染、ウイルストランスダクションまたはトランスフェクションに適合した、少なくとも１つの入口および少なくとも１つの出口を備え、入口がチューブの第１端に存在し、出口がチューブの第２端に存在し、チューブの長さ－対－直径の比が少なくとも４７５０：１であるチューブを有し、チューブが巻いたチューブであり、前記細胞およびウイルスが、細胞のウイルス感染、ウイルストランスダクションまたはトランスフェクションを維持するのに十分な時間チューブ内で保持されている、プラグフローチューブ型バイオリアクター」の発明である点。
(イ) 相違点
ａ 相違点１
チューブの巻回された形状の態様が、
本件補正発明においては、「コイル状」であるに対して、
引用発明においては、水平面内の一連の同心円として巻かれたものである点。
ｂ 相違点２
チューブの長さ－対－直径の比が、
本件補正発明においては、「少なくとも５０００：１である」のに対して、
引用発明においては、４７５０：１である点。
(５) 判断
ア 相違点１について
ａ(ａ) 「コイル」の字義は、「円状または螺旋状にぐるぐる巻いたもの」（広辞苑第七版）である。
(ｂ) そうすると、引用発明における「水平面内の一連の同心円として巻［かれた］」「管」は、「コイル状」であるといえるから、前記相違点１は、表現上の相違にすぎず、実質的な相違点とはいえない。
ｂ(ａ) なお、本願明細書の発明の詳細な説明の段落【００２１】の「このコイル状チューブ型バイオリアクターまたはバイオリアクターは一般に、比重を利用するために骨組み内に垂直位置に支持され、それによれば入口は管の上部に、出口は底部に存在する。」との記載を踏まえると、本件補正発明における「コイル状」という用語は、前記広辞苑における「螺旋状にぐるぐる巻いたもの」の意味、すなわち、「立体的形状」の意味での「コイル状」であって、引用発明のような「円状にぐるぐる巻いたもの」、すなわち、「平面的形状」のものは包摂しないとの意味であるとも考えられる。
(ｂ) そこで、「コイル状」の意味を、「螺旋状にぐるぐる巻いたもの」という「立体的形状」の意味であると善解して、引き続き検討を行う。
(ｃ) チューブ状のバイオリアクターを、螺旋状に巻いた状態で、一端が鉛直方向上部に、他端が鉛直方向下部に配置されるように円筒体又は円錐体に支持させることは周知技術である（前記「周知技術Ａ」）。
(ｄ) そうすると、前記(ｂ)のとおり善解したとしても、相違点１は、引用発明における平面的なコイル状の管を前記周知技術Ａのような立体的なコイル状の管に設計変更したものにすぎないから、相違点１は、設計上の微差にすぎず、実質的な相違点とはいえない。
イ 相違点２について
(ア) 引用発明においては、「チューブの長さ－対－直径の比」は「４７５０：１」であるものの、引用文献２全体の開示において、この値が「絶対に満たされなくてはならないもの」でないことは、明らかである。
(イ)ａ むしろ、引用発明における「より長い滞留時間で運転することによって、感染及びタンパク質産生段階の間の細胞生理学における変化をモニターするために使用され得るものであ[る]」との示唆等を踏まえると、引用発明の管状リアクターにおいて、細胞及びウィルスの滞留時間をより長くしてみようとすることは、当業者にとっては通常の創作能力の発揮にすぎない。
ｂ ここで、管状リアクター内での細胞及びウィルスの滞留時間をより長くするためには、管状リアクターの長さを長くするか、管状リアクター内の培地の線速度を遅くすれば良いところ、引用発明において、細胞を含む培地について、「混合が不十分であるため沈降する問題を克服」するために、「細胞を浮遊状態に保つのに十分な線速度を維持する」必要があるから、前者の対応を選択することは、当業者にとって自然なことであるといえる。
(ウ)ａ また、引用発明においては、「チューブの長さ－対－直径の比」は「４７５０：１」であり、本件補正発明の下限値である「５０００：１」と比較すると、その差は、わずか５．３％ほどの違いにすぎず、これは、引用発明における長さ=７．６ｍのシリコーン管を８ｍの長さに変更することにより満たされる数値にすぎない。
ｂ そして、本願明細書の発明の詳細な説明において、チューブの長さ－対－直径の比を具体的に特定した実験例は何ら示されていないことから、本件補正発明において、チューブの長さ－対－直径の比が「５０００：１」であることに、臨界的な意義を見出すことはできず、前記ａのわずかな差に基づいて、作用効果上の顕著な相違があるとは認められない。
(エ) そうすると、前記相違点２は設計上の微差にすぎず、実質的な相違点とはいえない。
ウ 総合評価
前記ア及びイにおいて検討したとおり、前記相違点１及び相違点２はいずれも設計上の微差にすぎず、引用発明において、これらの相違点に係る本件補正発明の構成を備えるようにすることは、引用発明に基づいて当業者が容易に想到し得たことである。
そして、前記相違点１及び相違点２を総合的に勘案しても、本件補正発明が奏する効果としては、当該構成のものとして当業者が予測・発見困難であり、かつ、格別顕著な効果を認めることはできない。
したがって、本件補正発明は、引用発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものである。
エ 請求人の主張について
請求人は、本件補正発明が進歩性を有する根拠として、引用発明は、本件補正発明で規定しているようなチューブの長さ－対－直径の比及びコイル状の形状を開示も示唆もしておらず、引用発明から、チューブ内での放射拡散が優位であって逆混合がなく、従来の経時的なＤＩＰの蓄積及び希望しない抗原性変異を克服することができるという優れた効果は全く予測されないことを主張している。
しかしながら、前記相違点１及び２が実質的な相違点といえないことは、前記(４)ア及びイにおいて説示したとおりである。
効果の点については、前述のとおり、本件明細書の発明の詳細な説明の記載に基づいては、「チューブの長さ－対－直径の比」が「４７５０：１」と「５０００：１」のわずかな差に基づいて作用効果上の顕著な相違があるとは認められない。
さらに、引用発明は、「セグメント化されたプラグフローを有する」ものであって「「継代効果」を回避するものであ」るから、本件補正発明と同様に、逆混合が抑制され、ＤＩＰの蓄積及び希望しない抗原性変異を低減できることは明らかである。
したがって、請求人の主張を採用することはできない。
(６) 独立特許要件の判断のまとめ
以上検討のとおり、本願補正発明は、引用発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法２９条２項の規定により、特許出願の際独立して特許を受けることができないものである。
したがって、本件補正により請求項１についてする補正は、特許法１７条の２第６項において準用する同法１２６条７項の規定に適合しない。
４ 本件補正の却下の決定の理由のむすび
前記３(６)のとおり、本件補正は、同法１７条の２第６項において準用する同法１２６条７項の規定に違反するから、同法１５９条１項において読み替えて準用する同法５３条１項の規定により却下すべきものである。
よって、前記補正の却下の決定の結論のとおり決定する。
第３ 本願発明について
１ 本願発明について
本件補正は、前記第２のとおり却下したので、本願の請求項１に係る発明（以下「本願発明」という。）は、本件補正前の特許請求の範囲の請求項１（前記第２の１(１)参照）に記載された事項により特定されるとおりのものである。
２ 原査定における拒絶の理由の概要
原査定の本願発明に対する拒絶の理由（進歩性の欠如）のうち、引用文献２を主たる引用文献とする進歩性欠如の拒絶理由の概要は、次のとおりである。
本願発明は、出願前に発行された下記の引用文献に記載された発明に基づいて、出願前にその発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法２９条２項の規定により特許を受けることができない。
記
＜主たる引用文献＞
引用文献２．YU-CHEN HU et al.，A tubular segmented-flow bioreactor for the infection of insect cells with recombinant baculovirus，CYTOTECHNOLOGY，1997年，24(2)，143-152
＜周知技術を示す引用文献＞
引用文献３．特開昭６２－１５８４７９号公報
引用文献４．米国特許第６１７４７２０号明細書
引用文献５．米国特許第５１３７８２８号明細書
引用文献６．特表２００７－５０５６１３号公報
引用文献７．特開平９－１２１８３５号公報
引用文献８．中国特許出願公開第１０５５０５７７５号明細書
３ 各引用文献に記載された事項及び引用発明の認定等
引用文献２には、第２の３(２)イにおいて認定したとおりの引用発明が記載されていると認められる。
また、周知技術Ａは、前記第２の３(３)イにおいて示したとおりである。
４ 対比・判断
本願発明は、前記第２の２(１)において検討したとおり、本件補正発明から「前記細胞およびウイルスが、細胞のウイルス感染、ウイルストランスダクションまたはトランスフェクションを維持するのに十分な時間チューブ内で保持されている」との限定を省いたものである。
そうすると、本願発明の発明特定事項を全て含み、更に限定したものに相当する本件補正発明が、前記第２の３(５)において説示したとおり、引用発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、本願発明も、同様の理由により、引用発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものである。
第４ むすび
以上検討のとおりであるから、本願発明は、特許法２９条２項の規定により、特許を受けることができない。
したがって、他の請求項に係る発明について検討するまでもなく、本願は拒絶すべきものである。
よって、結論のとおり審決する。
令和７年２月２６日
審判長 特許庁審判官 岡田 吉美
特許庁審判官 加々美 一恵
特許庁審判官 谷垣 圭二
（行政事件訴訟法第４６条に基づく教示）
この審決に対する訴えは、この審決の謄本の送達があった日から３０日（附加期間がある場合は、その日数を附加します。）以内に、特許庁長官を被告として、提起することができます。
審判長 岡田 吉美
出訴期間として在外者に対し９０日を附加する。
出典：特許庁「審決公報」（令和7年8月29日発行・号数2025-008、公報発行サイト https://www.gazette.jpo.go.jp/scciidl010 ）を加工して作成（加工：TaiLexi AI）
本文は公表資料（PDF 等）から機械的に抽出・整形したもので、改行や記号に誤りを含むことがあります。正確な文言は原本でご確認ください。